柱层析定义

柱层析，先在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相。将样品加到柱子上，用溶剂洗脱（洗脱剂），溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。整个过程为柱层析。

固定相：硅胶，氧化铝，凝胶，树脂等

固定相与样品作用方式如下图：

硅胶柱层析

下面以手动硅胶柱介绍层析柱的使用方法，分装柱、上样、洗脱、检测、收集五个部分。

在过层析柱之前，需要用硅胶TLC明确展开剂情况，通常以目标产物的Rf值在0.2~0.3时的展开剂为过柱子用的洗脱剂。

硅胶柱使用200~300目硅胶填装，属于吸附层析柱，极性小的样品在柱上吸附小，先被洗脱下来，极性大的样品会在柱上吸附时间较长，后被洗脱下来。

                 

仪器

色谱柱，铁架台，铁夹，烧杯，玻璃棒，滴管，一批试管，试管架等。

色谱柱选择：

色谱柱粗细影响装柱硅胶用量和柱高，根据样品量定好用硅胶量，以硅胶装柱后柱高在15 cm为佳。（难分的样品可以增加硅胶粉用量）

无砂板色谱柱使用前需要在底部塞上一小团棉花，防止漏硅胶。

有砂板色谱柱使用前需要检查砂板洁净度。

装柱

两种方法：湿法装柱和干法装柱。

硅胶用量：称量干燥粗样质量30~70倍的硅胶，通常40倍，难分样品100倍质量。

硅胶高度：一般为15 cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。

湿法装柱

先把硅胶用溶剂（洗脱剂中极性弱的溶剂，如PE/EA洗脱剂，用PE搅拌硅胶）拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂 "走柱子"。注意溶剂液面要保持高于硅胶面。柱子本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。

干法装柱

直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，最后再用泵直接抽，使得柱子装的很结实。接着是溶剂"走柱子"，一般用TLC分析得到的展开剂的比例再用非极性溶剂稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用真空泵抽，这样可以加快速度。等柱子全部浸润后，保持液面高于硅胶面。

装柱后

在硅胶的最上层铺上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。将溶剂放掉与硅胶面硅胶面相平，待用。

上样

上样也有干法和湿法之分。

湿法上样

用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，常用DCM溶解，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管吸取溶液，沿着层析柱内壁四周均匀加入。滴出液相，使液面与硅胶面相平，然后再用少量溶剂洗涤样品瓶，再加入。

干法上样

将待分离的样品（通常是需要极性大的溶剂才能溶解的样品）用少量溶剂溶解后，再加入少量硅胶，拌匀后用旋转蒸发仪旋去溶剂。旋至硅胶粉干燥。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。

洗脱

洗脱可以用单一洗脱剂也可以用梯度洗脱。单一洗脱简单，梯度洗脱分离效果好但是费溶剂。

单一洗脱剂：通过TLC选择好洗脱剂，Rf值在0.2~0.3的展开剂为洗脱剂，不断淋洗柱子。

梯度洗脱：配置一系列浓度配比的洗脱剂，从低极性开始洗脱。例如在PE:EA =70:30时，样品Rf=0.3，可以配置PE：EA分别为85：15，80：20，85：25 ，70：30，65：35等。每种洗脱剂走两个柱高。

洗脱的馏分收集要根据样品量，用合适体积的容器等份盛装。

检测

将收集的馏分逐一点板（TLC），用适当的显色方法确定给馏分中含有的样品。

收集

将具有相同样品的馏分收集，并用旋转蒸发仪旋干。