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◆熟悉基因工程的概念、原理、主要步骤及在医学上的应用。

肿瘤的发生是由于肿瘤细胞的异常生长、增殖和分化引起的，而调控肿瘤细胞恶性生长增殖的基因有两类：一类是促进细胞增殖，具有致癌潜在能力的基因，称为癌基因。另一类是抑制细胞生长增殖，具有抑制肿瘤形成的基因，称为抑癌基因。当这两类基因的任何一种或两种发生变化，即可引起细胞生长失控，导致肿瘤发生。肿瘤的发生又是一个复杂的多基因改变过程，与癌基因、抑癌基因及生长因子的异常表达有密切关系。

基因表达主要是指DNA结构基因中遗传信息通过基因激活、转录和翻译合成具有特定功能的蛋白质分子的整个过程。而tRNA和rRNA基因的转录是基因表达的另一种方式。基因表达可分为两类：组成性基因表达和适应性基因表达。组成性基因表达是指不大受环境变动而变化的一类基因表达。其表达产物是细胞或生物体整个生命过程中都持续需要并且必不可少的，通常被称为看家基因。适应性基因表达是指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导，这类基因被称为可诱导的基因。应环境条件变化基因表达产物水平降低的现象称为阻遏，这类基因被称为可阻遏的基因。基因表达调控的意义在于：一是使生物体各组织具有不同的物质代谢功能；二是使机体在生长、发育的不同阶段，基因表达按先后次序进行。即基因表达具有很强的空间性和时间性，以便使机体能更好地适应内外环境的变化和生命过程的需要。

（一）原核生物基因表达调控

1961年，Jacob和Monod根据对大肠杆菌乳糖代谢调节的研究，提出了“操纵子”学说。所谓操纵子，就是原核生物基因表达调控的基本单位，它是由一组结构基因和位于其上游的启动基因（启动子）和操纵基因组成。启动基因是RNA聚合酶在转录起始时的结合部位，操纵基因是控制RNA聚合酶向结构基因移动的必经部位，相当于转录的“控制闸”，闸门打开，结构基因便被转录。闸门是开还是关，受位于启动基因上游的调节基因表达的阻遏蛋白（辅阻遏蛋白）及诱导剂（阻遏剂）的影响（图12－1），这是原核生物基因表达调控的主要方式，也称负性调控；而正性调控是指cAMP与分解代谢基因活化蛋白（CAP）结合形成cAMP－CAP结合到启动基因的CAP位点上，促进转录进行，协助负性调控使细胞适应环境的变化。

（二）真核生物基因表达调控

真核基因组分子巨大，结构复杂，调节也更复杂，但可简单描述为由顺式作用元件和反式作用因子调控的。顺式作用元件是指对基因转录有调控作用的DNA序列；反式作用因子是指能直接或间接与DNA调控元件结合而发挥作用的蛋白质因子。顺式作用因子包括启动子和增强子，反式作用因子主要是一些蛋白质因子。

基因工程是人工使某特定基因（目的基因）经载体（vector）携带，进入某生物细胞或重组入其DNA分子中，经筛选、纯化、扩增，并使之表达出人类所需要的蛋白质或对人类有益的生物性状的技术，也称基因克隆或重组DNA技术。它是人工定向改变生物遗传信息的技术，是分子生物学中进展最迅速的技术，已经并将继续为整个生命科学（包括医药卫生各学科）作出不可估量的贡献。

载体是基因工程中DNA片段的重要运载工具，但本身是小型DNA分子，它能把适当大小的外源DNA（非载体自身DNA）插入自身分子中而转入宿主细胞，并可在宿主细胞中复制。常用的载体有：

1.质粒（plasmid）　是存在于细菌胞浆中的非染色体环状DNA，长度为1～200kb（千碱基对），能在宿主细胞内进行自身复制。较好的质粒在宿主细胞中自身复制快，有多个常用限制性内切酶的特异单一位点，容易插入外源DNA。

2.噬菌体（phage）　是一类细菌的病毒，能侵入细菌体内并在其中生长繁殖（DNA复制）。常用λ噬菌体，可感染大肠杆菌。噬菌体可携带较大的DNA片段。

3.病毒载体　某些病毒DNA能携带外源DNA并在动物细胞中增殖，如SV₄₀（simi－an virus40，猿猴40病毒）已转运兔血红蛋白β－链基因到非洲猴肾培养细胞中并表达成功。

4.柯斯质粒（cosmid）　又译为黏粒，由细菌的质粒和噬菌体的黏性末端构建而成，可感染进入细胞，可转运29～45kb的DNA片段。既可感染细菌，也可感染哺乳动物细胞，进行基因表达。

（二）限制性内切酶

限制性内切酶（restriction endonuclease）是基因工程的重要工具酶，识别DNA双链中特异核苷酸顺序，并在该处水解切开。某些限制性内切酶的切口是错开的，以致切口两边各有几个核苷酸的单链，称为黏性末端（cohesive end）。相反，若切口不错开，叫平头末端（flush end或blunt end）。具黏性末端时很容易与同一限制性内切酶切开的载体DNA或染色体DNA的黏性末端结合，因为它们的黏性末端是互补的。限制性内切酶的发现和应用使DNA体外重组成为可能。在基因工程和分子生物学中，没有任何一种酶像限制性内切酶这样举足轻重和广泛应用。

在基因工程中可将限制性核酸内切酶切割好的目标DNA和载体DNA连接成重组DNA分子。

基因工程的基本过程是：①制备目的基因；②基因构建重组体（目的基因和载体连接）；③转化或转染（将重组体导入宿主细胞）；④筛选纯化后，目的基因进行扩增、表达及表达产物的获得（图10－27）。

（一）制备目的基因

目标DNA也称目的基因，是指为达到目的而选定的欲转导、克隆、表达的基因。目标DNA可通过以下几个方面获得：

（1）从基因组中直接分离。

（2）逆转录：对于真核生物来说，直接分离比较困难，但是可从胞质中分离得到相应的mRNA，通过逆转录机制可获得cDNA。

基因工程中常用工具酶有何作用特点？目标DNA、载体DNA可以从哪几方面获得？

（3）人工合成：对于简单的DNA序列可进行人工合成。

（4）聚合酶链反应（PCR）：这是一种常用的DNA扩增技术，在获取目标DNA中应用十分广泛。

（二）构建重组体

用于制备目的基因时所选定的同一限制性内切酶切开载体，使目的基因和载体DNA两端有互补的黏性末端。二者在一起保温，其黏性末端可自发地进行碱基互补配对形成氢键。再用DNA连接酶连接缺口，使目的基因重组入载体环状DNA中。平头末端者则需加上人工接头构成黏性末端。也可在连接酶作用下连接，但需要的酶和底物量大、连接效率低。

（三）重组DNA的转化

把插入了目的基因的载体称DNA重组体。它可进入受体细胞（宿主细胞）自主进行复制，或把目的基因DNA整合到受体细胞DNA中再进行复制、表达。把用细菌质粒作载体的重组体导入受体细胞的过程叫转化（transformation）。把用噬菌体、病毒作载体，构建的重组体导入受体细胞的过程称转染（transfection）。

（四）筛选，纯化、扩增、表达及表达产物的获得

要进行目的基因的表达，必须筛选、纯化出已经准确而成功地转化或转染了的受体细胞，常用的方法主要是根据遗传表型筛选纯化和利用酶基因标志筛选。筛选、纯化后的单一细胞或菌落，再进行培养繁殖使之成为增殖系，即细胞克隆。随细胞克隆不断进行，重组DNA分子在受体细胞中不断复制而使目的基因不断扩增。

基因工程的目的是使目的基因高效表达，产生对人类有价值的蛋白质产品或对人类有益的生物性状。目的基因的表达及表达产物的检测、获得，实际上相当复杂，尽管其研究进展很快，但仍有大量理论和技术问题有待解决。尽管困难不少，但基因工程已取得了诸多极其重要的进展，并显示出其广阔的发展前景。仅在医药卫生领域，正在开发的医用活性多肽和疫苗已达100种以上，如人胰岛素、生长激素、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、麻风疫苗、百日咳疫苗、乙型肝炎疫苗等。已投放市场的有：生长激素、乙肝疫苗等。使用DNA探针（用同位素等标记的与某基因互补的单股DNA片段）技术检测基因缺陷或突变已被应用于遗传病、传染病、肿瘤作基因诊断及法医鉴定等很多领域。基因治疗也已开始，目前研究多在单基因缺陷所致的疾病，1990年治疗腺苷脱氨酶缺陷症已获成功。基因工程的研究可改变生物遗传性状，创造新品种。如1983年已把生长激素基因移入小白鼠受精卵，培育出体重增加2倍的“超级鼠”（转基因鼠）。我国把此激素基因移入鱼卵，其鱼幼苗生长速度提高了2倍。近年来，我国已完成了抗棉铃虫棉花、抗冻西红柿、克隆绵羊、克隆牛、克隆山羊等应用基因工程的研究。

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