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◆描述遗传信息传递的中心法则与DNA复制的概念、特点、反应条件及其作用。

DNA是遗传的物质基础，其分子中的碱基排列顺序携带遗传信息。基因是DNA分子中某个功能片段。它是编码一条多肽链或一个RNA（如tRNA、rRNA等）分子所必需的全部DNA碱基序列。在遗传信息传递过程中，以亲代DNA为模板合成与之完全相同的子代DNA，称为DNA复制（DNA replication）。通过复制把亲代遗传信息准确传递到子代。DNA中的遗传信息可以通过转录、翻译表达为生物性状。转录（transcription）是在DNA指导的RNA聚合酶催化下，以单链DNA为模板按碱基配对原则合成RNA分子的过程。通过转录把生物体DNA携带的遗传信息传递给RNA。转录可生成mRNA、tRNA和rRNA。翻译（translation）是指以mRNA为模板，以其分子中碱基顺序所决定的遗传密码为指导，合成蛋白质的过程。蛋白质是细胞的基本化学成分，是各种组织结构、生物功能的物质基础。通过转录和翻译，把DNA遗传信息转变为有功能的蛋白质的过程称为基因表达（gene expression）。1958年Crick把遗传信息的这种传递规律称为中心法则（central dogma）。但1970年Temin及Baltimore分别从致癌RNA病毒中发现了反转录酶，从而证明了RNA为模板也可反转录合成DNA，这种遗传信息传递的方向与转录正好相反，故称逆转录（reverse transcription）或反转录。后来还发现某些RNA病毒中的RNA也可自身复制。这对中心法则进行了补充和修正（图10－1）。

DNA复制方式是半保留复制。在DNA复制时，以亲代DNA解开的两条单链为模板，按照碱基互补配对原则，各自合成一条与之互补的DNA单链，成为两个与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子，在子代DNA分子中一条链是新合成的，另一条链则是保留亲代的，故称半保留复制。

1958年，Meselson和Stahl的实验证明，DNA复制为半保留式（图10－2）。他们使用一种特殊的细菌培养液，研究大肠杆菌（E.coli）DNA复制过程。培养液中，氯化铵的氮原子是较重的同位素¹⁵N，而不是通常的¹⁴N。首先，他们将E.coli在这种重氮介质中连续培养15代，使DNA中的氮原子完全被¹⁵N所取代，其DNA密度比通常含¹⁴N的DNA大约高1%，两者在氯化铯密度梯度离心中形成不同的区带。然后，他们将这些细胞转移到轻氮（¹⁴N）介质中，并提取第二代E.coli DNA，发现其密度介于轻、重DNA之间，提示：全保留式复制是不可能的。接着，他们提取经过两次复制的第三代DNA，发现一半为中间密度DNA，另一半为轻DNA，这一结果符合半保留复制的特点，排除了散布式DNA复制的可能性。随着E.coli在轻氮介质中培养代数的增加，轻DNA区带所占的比例越来越大，而中间密度区带越来越少，证明DNA复制确实是半保留式的。

（一）参与复制的原料

dATP、dTTP、dCTP、dGTP，且数量上前二者相等，后二者相等。

（二）参与复制的酶类

1.DNA聚合酶　又称为DNA指导下的DNA聚合酶（DNA directed DNA polymerase，DDDP），在适量DNA作模板、RNA作引物的条件下，可催化四种dNTP聚合成DNA，故称之为DNA指导的DNA聚合酶。把先发现者称DNA聚合酶I（DNA pol I，DDDPI），后发现者分别称为DNA聚合酶Ⅱ（DNA polⅡ，DDDPⅡ）和DNA聚合酶Ⅲ（DNA polⅢ，DDDPⅢ）。

大肠杆菌DNA pol I是一种多功能酶：①催化冈崎片段由5′→3′方向延长。②能识别并按3′→5′方向切除DNA片段或引物的3′末端的错误配对碱基。③在复制过程中按5′→3′方向切除引物，并在引物切除后的空缺延长DNA片段。还有修复DNA损伤的作用。DNA polⅡ因含量少（＜100个分子/细胞）、活性低（仅有DNA pol I的5%），功能尚难定论。DNA polⅢ活性最大，每分子酶每分钟可使1.5万～6.0万个脱氧核苷酸聚合，是真正的DNA复制酶。大肠杆菌DNApolⅢ是由10种共22个亚基组成的不对称二聚体（图10－3）。不对称二聚体的酶结构有利于其在复制叉上同时催化先导链和随从链的合成。

在真核细胞中已发现α、β、γ、δ、ε5种DNA聚合酶，其中α是合成引物和随从链，β是损伤修复酶，γ是线粒体DNA复制的酶，δ参与复制时合成先导链，ε在复制中起校读、修复和填补引物空隙的作用。

DNApol的主要作用是催化形成磷酸二酯键。具有3个特点：①只有模板DNA存在时才有酶活性，而且底物必须是dNTP。②只能在原有的DNA片段或RNA引物片段的3′－OH端上连续逐个加上脱氧核苷酸，延长DNA链；③聚合反应的延长方向是由5′→3′，即子链按5′→3′延长，模板按3′→5′被复制。

2.解链和解旋酶类　DNA分子是双螺旋结构，原核细胞环状DNA还可形成超螺旋结构；真核细胞则更复杂。在双螺旋链中，碱基皆在双螺旋结构的内侧，如果不解开复杂的螺旋和双链，碱基就不能外露，无法进行复制。故需要解旋、解链的酶类和蛋白质参与。

（1）解螺旋酶（helicase）：即rep蛋白，也称解链酶。此酶通过水解ATP获得能量，解开双螺旋链间氢键成单链DNA。在复制叉前解开一小段DNA，并沿复制叉前进的方向移动。

（2）单链结合蛋白（single－strand binding protein，SSB）：在DNA复制时，一旦较短的单股DNA链形成，几分子单链结合蛋白立即牢固地结合上去，防止恢复双链，并对抗核酸酶、保护单链不被破坏。此蛋白在复制过程中可反复被利用（图10－4）。

（3）拓扑异构酶（topoisomerase）：复制时DNA解链是一种高速反向旋转，可造成下游发生缠绕和打结现象。拓扑异构酶使复制中的DNA解结、解环，克服打结、缠绕现象。①拓扑异构酶I（topoisomerase I）能迅速使环状超螺旋DNA解旋，而不改变其化学组成。作用机制可能是先切开双链DNA中的一条链，此切口的游离磷酸基与酶分子结合，使该链末端沿螺旋轴按超螺旋反方向转动，消除超螺旋后再将切口封闭。无需ATP供能。②拓扑异构酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ）有两个亚基，一个切断DNA双股链；另一个可水解ATP释放出能量。前者切开双链后使之反超螺旋方向转动以消除超螺旋，在无ATP时即重新封闭；在有ATP时，后者水解ATP释出能量，使双链按反超螺旋方向再旋转，形成负超螺旋后再封闭之（图10－5）。

3.DNA连接酶（DNA ligase）　可催化两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来。反应需ATP供能（图10－6）。图上方是双链状态下连接酶的作用，图下方把被连接的缺口放大，表示出化学反应。

4.引物酶（primase）和引发体（primosome）　由于DNA聚合酶只能在已有的引物RNA或DNA的3′－OH端上按5′→3′方向催化连续合成DNA，故必须由引物酶与引发前体结合成引发体，催化引物合成。ФХ174DNA复制时，其引发前体由priA、priB、priC、dnaB、dnaC和dnaT 6种蛋白组成，其中priB可识别起始原点，并取代单链结合蛋白结合于此原点。DnaB－dnaC复合物可使起始原点DNA变构，以利于引物酶结合DNA催化引物合成。

（三）DNA复制的过程

1.起始　一般认为生物复制是从一个特定核苷酸顺序的固定点开始同时向两个方向进行，此点称复制起始点（replication origin）。真核生物的复制起始点一般有多个。复制起始时，在拓扑异构酶和解链酶作用下，从复制起始原点开始，向两端同时打开DNA局部双链，形成复制泡（replication bubble），此时单链结合蛋白结合在单链上以稳定其单链结构。复制泡从一个方向看，解开的两股单链和未解开的双螺旋形似叉子，故名复制叉（replication fork）。从原点开始，复制呈双向展开，称为双向复制（bidirectional replica－tion）。随复制的展开，复制叉向两端方向移动，复制泡不断扩大（图10－7）。

模板链是由3′→5′被复制的，复制出的子链是由5′→3′延伸的。由于DNA双链走向相反，形成复制叉后两模板链也必然走向相反，则合成子链的延伸方向也必不相同，其中，延伸方向朝向复制叉的子链称先导链（leading strand），背向复制叉的子链称随从链（lagging strand）。复制过程在复制体（replisome）催化下进行，复制体由解链酶、引发体和呈不对称二聚体的DNApolⅢ组成，复制体同时复制出先导链和随从链。开始复制先导链时，复制体中引发体内的引物酶直接识别并结合于其模板的复制起始原点，由此点开始按3′→5′沿模板链滑动，使RNA引物由5′→3′合成。之后引物酶脱离模板，复制体中DNA polⅢ的一个单聚体结合该模板，在引物3′端上接续由5′→3′连续地合成先导链。而在随从链模板上，此时因无复制起始原点，引物酶不与此模板链结合，随着复制体沿先导链模板朝复制叉方向滑动。当随从链模板出现复制起始原点时，引发前体中priB识别并结合于该原点，dnaB－dnaC复合体随之亦结合上去促进局部DNA变构，有利于其余引发前体蛋白结合（图10－8）。当复制体滑动到此原点时，引发前体即与其中的引物酶结合形成引发体，使复制体与随从链模板链结合。这就形成复制体同时与先导链和随从链模板均结合着的结构。引发体形成后，引物酶与随从链模板起始原点结合，沿该模板链按3′→5′方向合成引物，之后，引发前体则脱离引物酶沿该模板链按5′→3′方向滑动以寻找下一个起始原点。由于引物酶沿随从链模板按3′→5′方向（背向复制叉）催化引物按5′→3′方向合成，而复制体又不断地继续向复制叉方向滑动，结果导致随从链模板链开始绕成180°的环。引物合成后，引发酶脱离模板链，复制体中DNApolⅢ的另一单聚体接续在该引物3′端后在随从链模板由3′→5′滑动，按5′→3′合成随从链，使这个环越来越大。到达前一引物5′端时，DNApolⅢ单聚体即脱离该模板链，环亦随即被打开。当复制体在朝复制叉方向滑动中遇见随从链下一个起始位点时，早已滑动到并结合在该位点的引发前体即再与复制体中引物酶结合成引发体，又开始上述合成引物过程并再形成环，在合成随从链之后又打开环。

2.延长　以解开的DNA单链为模板，dNTP为原料，在DNApolⅢ的两个单聚体分别催化下，先导链连续合成，由5′→3′延长。随从链则是合成一个一个的随从链片段，此片段长1000～2000个碱基，是日本人冈崎正治（Reiji Okazaki）首先发现，故称为冈崎片段（Okazaki fragments）。当随从链合成到一定长度后，冈崎片段之间的引物被DNApol I按5′→3′方向切除，此酶同时催化冈崎片段3′端按5′→3′方向延伸，到达前一个冈崎片段5′端时，DNA pol I脱落，再由连接酶催化连接延长了的冈崎片段成DNA长链。

3.终止　对环形DNA分子，随从链中合成的最后一个延长了的冈崎片段3′端和起始点合成的延伸了冈崎片段的5′端，由连接酶催化连接成环。而在先导链则其3′端和起始点先导链的5′端直接焊接成环。对线形DNA分子，详细情况还不十分清楚。已知真核生物线形DNA分子合成终止时，存在一个端粒（telomere）结构，还需端粒酶（telom－erase）的参与，其详细情况是目前肿瘤研究中的一个新领域。

（四）DNA的损伤、修复和基因突变

紫外线、电离辐射、化学诱变等使DNA在复制过程中发生突变，这一过程叫DNA损伤。其实质就是DNA分子上碱基的改变，造成DNA结构和功能的破坏，导致基因突变。损伤可分两大类，即自发性损伤和环境因素损伤。所谓自发性损伤是还未找到特异环境有害因素的损伤，故此两大类有时很难区别。

DNA修复基因的改变会导致突变率增加，从而大大增加个体对癌症的易感性。编码参与DNA损伤核苷酸切除修复、错配修复、重组修复的基因缺陷均与人癌症的发生相关联，DNA损伤修复是一件生死攸关的事情。每年在北美洲大约有180 000女性被诊断为乳腺癌，大约1/5的患者是家族性的或遗传因素引起的，还有1/3是因为两个编码同类蛋白的基因brca1或brca2发生突变而引起的。

1.DNA自发性损伤

（1）DNA复制错误：碱基配对错误频率1%～10%，因为DNA pol的校读作用，使复制错误很低，仅10^－9。

（2）碱基的自发性损伤：碱基中的氨基（—NH₂）、酮基（C＝O）和烯醇基（═C—OH）常发生异构转变、丢失等。

2.环境因素对DNA损伤

（1）化学物质：①烷化剂：如氮芥、环磷酰胺等，可使鸟嘌呤的第7位N发生烷化而除去鸟嘌呤。②亚硝酸盐、丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素和各种铂的衍生物，能结合在碱基上，使DNA碱基发生链内或链间交联，进而阻止了复制和转录。③代谢活化的化学物质：如苯并芘活化后与鸟嘌呤第二位氨基结合，导致损伤；黄曲霉素活化后亦可攻击某些鸟嘌呤，它们都是致癌剂。④碱基或核苷类似物：如5－氟尿嘧啶、6－巯基嘌呤等既阻止核苷酸合成，又阻止DNA复制和表达。⑤染料：如吖啶黄、二氢吖啶等可嵌入DNA双链间，影响其复制和转录。

（2）物理因素：①紫外线照射：大量照射可使两个相邻嘧啶共价结合形成嘧啶二聚体（如TT）；紫外线还可使DNA链断裂。②电离辐射：可使磷酸二酯键破坏从而使DNA链断裂。

3.DNA损伤的修复

（1）无差错修复：通过修复，DNA损伤得到完全恢复。①直接消除修复：包括光复活作用和转甲基作用修复。前者是在光复活酶催化下，使嘧啶二聚体解离而修复。此酶可受蓝光激活，人体仅在淋巴细胞和成纤维细胞中发现，故称为非重要修复方式。后者是在转甲基酶催化下，使6－氧甲基鸟嘌呤中的甲基除去而修复。此酶把鸟嘌呤的甲基转接到酶蛋白自身，使酶自杀灭活。②切除修复，亦称暗修复，是人体重要的修复方式。其修复过程是：核酸内切酶先特异识别并结合于损伤部位，在其5′端切断磷酸二酯键，DNA pol I在切口的3′端，以完整的互补链为模板，按5′→3′方向合成DNA链进行修补。同时在切口5′端，发挥其5′→3′外切酶作用，切除包括损伤部位在内的一小段DNA。最后由DNA连接酶把新合成的修补片段和原来的DNA断裂处连接起来（图10－9）。

（2）有差错修复：即修复后仍有DNA碱基序列差错。①重组修复：又称复制后修复。损伤的DNA先进行复制，结果，无损伤DNA的单链复制成正常DNA双链，有损伤DNA单链由于损伤部位不能被复制，出现有一条链带缺口的DNA双链。通过分子重组，把定位于亲代单链的缺口相应顺序转移、重组到该缺口处填补。亲代链中的新缺口因为互补链是正常的，可由DNA pol I修复，连接酶连接。但亲代DNA原来的损伤仍存在（图10－10）。如此代代复制，该损伤链逐代被稀释。②SOS（save our souls）修复：当DNA分子受到大范围严重损伤时，影响到了细胞存活，可诱导细胞产生多种复制酶和蛋白因子，它们对碱基识别能力差，但能催化空缺部位DNA合成。此修复虽有错误，但抢救了细胞生命。

（五）基因突变

如果DNA的损伤不是致死性的，而又未得到修复或者难以完全修复，结构异常的DNA通过复制把变异遗传到子代，造成子代生物性状改变称为基因突变（gene muta－tion）。凡可引起这种遗传性DNA损伤的因素称为突变剂（mutagen）。由突变剂引发的基因突变叫诱发突变（induced mutation），反之，为自发突变（spontaneous mutation）。

反转录（reverse transcription，亦译为反向转录、逆转录），是在反转录酶催化下，以RNA为模板，以dNTP为原料合成DNA的过程。

1964年Temin根据放线菌素D特异抑制致癌病毒在癌细胞中复制的实验，提出致癌RNA病毒在癌细胞复制中需先合成DNA（前病毒），此DNA插入到细胞DNA中，再转录出RNA，其表达产物使细胞癌变。1970年Temin和Baltimore分别从Rous病毒和鼠白血病病毒中分离出了反转录酶（reverse transcriptase），亦称RNA指导的DNA聚合酶（RNA directed DNA polymerase，RDDP），从而证明了RNA可反转录成DNA。

反转录酶功能是：①以RNA为模板，dNTP为原料，按5′→3′方向合成DNA，合成起始时需色氨酸tRNA（tRNATrp）作引物。②具有核酸酶H作用，能特异从DNA－RNA杂交体中切除RNA及引物。③DNA pol的作用，可以单链DNA为模板合成双链DNA。

反转录的基本过程（图10－11）是反转录酶以（病毒）RNA为模板，以dNTP为原料，在tRNA^Trp引物的3′－OH上接续合成DNA（负链），形成RNA－DNA杂交体。DNA负链合成快完成时，模板RNA和引物先后被反转录酶水解除去，留下单股DNA负链，称互补DNA（complementary DNA，cDNA）。反转录酶再以DNA负链为模板催化合成DNA单链（正链），成为DNA双链。此双链DNA保留了病毒RNA遗传信息，可直接整合到宿主细胞DNA中，转录出RNA病毒的RNA，进而合成RNA病毒，故称之为前病毒（provirus）。

反转录作用的发现，大大扩充和发展了中心法则，即在Crick提出的中心法则的基础增添了RNA反转录成DNA、RNA自身复制及其表达，而且还使人们对RNA病毒致癌机制有了进一步的认识。后来又发现反转录酶也存在于正常细胞，如蛙卵、正在分裂的淋巴细胞、胚胎细胞等，推测可能与细胞分化和胚胎发生有关。在基因工程中，当目的基因制备困难时，可根据已知某蛋白质的氨基酸顺序，合成其mRNA，再以mRNA为模板反转录成cDNA，后者扩增后既可作cDNA探针，也可再转变成cDNA双链，进行DNA重组或建立cDNA文库，从中很易筛选出目的基因。

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