第四节　蛋白质的理化性质

二、蛋白质的高分子性质

蛋白质是高分子化合物，相对分子质量在1万至100万kDa之间，甚至更高。蛋白质分子颗粒的直径一般在1～100nm，达到胶体颗粒的范围，因此具有胶体溶液的性质，如丁道尔现象、布朗运动、不能透过半透膜、扩散速度减慢、黏度大等特征。

想一想：

维持蛋白质亲水胶体性质的两个稳定因素是什么？

蛋白质分子表面含有很多亲水基团，如氨基、羧基、羟基、巯基、酰胺基等，能与水分子形成水化层，把蛋白质分子颗粒分隔开来。此外，蛋白质在一定pH溶液中都带有相同电荷，因而使颗粒相互排斥。水化层的外围，还可有被带相反电荷的离子所包围形成双电层，这些因素都是防止蛋白质颗粒的互相聚沉，促使蛋白质成为稳定胶体溶液的因素（图1－9）。

图1－9　蛋白质的稳定因素与沉淀

蛋白质分子不能透过生物膜的特点，在生物学上有重要意义，它能使各种蛋白质分别存在于细胞内外不同的部位，对维持细胞内外水和电解质分布的平衡、物质代谢的调节都起着非常重要的作用。另外，利用蛋白质不能透过半透膜的特性，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入半透膜袋内，然后将袋浸于蒸馏水中，小分子物质由袋内移至袋外水中，蛋白质仍留在袋内，这种方法叫做透析。透析是纯化蛋白质的方法之一。

三、蛋白质的沉淀

蛋白质从溶液中以固体状态析出的现象称为蛋白质的沉淀。它的作用机制主要是破坏了水化膜或中和蛋白质所带的电荷。沉淀出来的蛋白质，根据实验条件，可以是变性或不变性。其主要沉淀方法如下。

（一）盐析法

在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）破坏蛋白质的胶体稳定性，使蛋白质从溶液中沉淀出来，称为盐析。它的机制是高浓度的盐溶液中的异性离子中和了蛋白质颗粒的表面电荷，从而破坏了蛋白质颗粒表面的水化层，失去了蛋白质胶体溶液的稳定因素，降低了溶解度，使蛋白质从水溶液中沉淀出来。盐析所得蛋白质加水稀释尚可复溶。盐析时，若把溶液pH值调节至该蛋白质的等电点，则沉淀效果更好。根据各种蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，在盐析时需要盐的浓度也不一致。因此，调节中性盐的浓度，可使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法称分段盐析法。临床检验中常用此法来分离和纯化蛋白质。盐析法一般不引起蛋白质变性，是分离纯化蛋白质的常用方法之一。

（二）重金属盐沉淀蛋白质

蛋白质可以与重金属离子（如汞、铅、铜、锌等）结合生成不溶性盐而沉淀。此反应的条件是溶液的pH值应稍大于该蛋白质的等电点，使蛋白质带较多的负电荷，易与带正电荷的重金属离子结合。

临床上常用蛋清或牛乳解救误服重金属盐的病人，目的是使重金属离子与蛋白质结合而沉淀，阻止重金属离子的吸收。然后，用洗胃或催吐的方法，将含重金属离子的蛋白质盐从胃内清除出去，也可用导泻药将毒物从肠管排出。

（三）某些酸类沉淀蛋白质

蛋白质可与钨酸、苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、磺柳酸等发生沉淀。反应条件是溶液的pH值应小于该蛋白质的等电点，使蛋白质带正电荷，与酸根负离子结合生成不溶盐而沉淀。生化检验中常用钨酸或三氯醋酸作为蛋白沉淀剂，以检查尿蛋白或制备无蛋白血滤液。

（四）有机溶剂沉淀蛋白质

乙醇溶液、甲醇、丙酮等有机溶剂可破坏蛋白质的水化层，因此，能发生沉淀反应。如把溶液的pH值调节到该蛋白质的等电点时，则沉淀更加完善。在室温条件下，有机溶剂沉淀所得蛋白质往往已发生变性。若在低温（0～4℃）条件下进行沉淀，则变性作用进行缓慢，故可用有机溶剂在低温条件下分离和制备各种血浆蛋白。此法优于盐析，因不需透析去盐，而且有机溶剂很易通过蒸发去除。

议一议：

使蛋白质沉淀的方法有哪些？蛋白质的变性与沉淀有什么关系？

乙醇溶液作为消毒剂，作用机制是使细菌内的蛋白质发生变性沉淀，而起到杀菌作用。

四、蛋白质的变性

天然蛋白质受理化因素的作用，使蛋白质的构象发生改变，导致蛋白质的理化性质和生物学特性发生变化，但并不影响蛋白质的一级结构，这种现象叫变性作用。变性的实质是次级键（氢键、离子键、疏水作用等）的断裂，而形成一级结构的主键（共价键）并不受影响。变性后的蛋白质称变性蛋白质，其特点如下：

说一说：

何为蛋白质变性？哪些因素可促使蛋白质变性？

（1）蛋白质溶解度降低。在等电点的pH溶液中可发生沉淀，但仍能溶于偏酸或偏碱的溶液。

（2）生物活性丧失，如酶的催化功能消失，蛋白质的免疫性能改变等。

（3）变性蛋白质溶液的黏度往往增加。

（4）变性蛋白质容易被酶消化。

能使蛋白质变性的物理因素有加热（70～100℃）、剧烈振荡、超声波、紫外线和X射线的照射。化学因素有强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属盐、生物碱试剂、有机溶剂等。如果蛋白质变性仅影响三、四级结构，其变性往往是可逆的。如被盐酸变性的血红蛋白，再用碱处理可恢复其生理功能。胃蛋白酶加热到80～90℃时失去消化蛋白质的能力，如温度慢慢下降到37℃时，酶的催化能力又可恢复。

天然蛋白质变性后，所得的变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插结合在一起的现象称为蛋白质凝固。蛋白质凝固后一般都不能再溶解。变性蛋白质不一定发生沉淀，即有些变性蛋白质在溶液中不出现沉淀，凝固的蛋白质必定发生变性，而沉淀的蛋白质不一定发生凝固。

【知识链接】

患者，男，48岁，因阑尾炎住院，需行阑尾切除手术，术前准备工作摘要如下：

1.手术室保持整洁、无菌，室内空间应用紫外线照射消毒（每次不少于1h）。

2.检查阑尾切除备用手术包消毒有效期。备用手术包的准备过程：将手术专用器械及敷料备齐、刷净、包好，按要求进行高压蒸汽消毒，注明消毒日期。

3.手术人员使用肥皂刷洗双手及上臂，用5%碘伏涂抹双臂、双手，穿无菌手术衣、戴无菌手套等。

4.病人腹部手术区备皮。应用5%碘伏常规皮肤消毒，铺无菌手术巾。

分析思考：

（1）术前采取上述措施的目的是什么？

（2）分析说明采取这些措施的理论依据。

五、蛋白质的紫外线吸收特征及呈色反应

（一）蛋白质的紫外线吸收特征

蛋白质分子中常含酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，在280nm紫外光谱处有一特征性吸收峰。在该波长处，蛋白质的吸光度与其浓度呈正比，因此，常用于蛋白质的定量测定。

（二）蛋白质的呈色反应

1.双缩脲反应　双缩脲由两分子尿素加热缩合而成，双缩脲在碱性条件下与硫酸铜发生紫红色反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此，也能发生类似反应，呈紫红色，对540nm波长的光有最大吸收峰，通常用此反应来鉴定蛋白质和定量测定。

2.福林（Folin）反应（酚试剂反应）　蛋白质分子中含有一定量的酪氨酸残基，其中的酚基在碱性条件下与酚试剂的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物，根据颜色的深浅可作为蛋白质的定量测定，其反应的灵敏度比双缩脲反应高100倍。

3.茚三酮反应　蛋白质分子游离的α－氨基能与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，此化合物在570nm波长处有最大吸收峰。由于此吸收峰的大小与蛋白质的含量成正比，因此可作为蛋白质定量分析方法。

小　结

蛋白质是生命的物质基础，它不仅在生物体内含量丰富，而且具有多种多样的生物学功能。组成蛋白质的主要元素有碳、氢、氧、氮、硫等，各种蛋白质的平均含氮量为16%左右，这是蛋白质元素组成的重要特点，也是蛋白质定量测定的依据。

蛋白质的基本组成单位是氨基酸。构成人体的氨基酸有20种，且基本上为L－α－氨基酸。氨基酸在同一分子上有碱性的氨基和酸性的羧基，故能与酸类或碱类物质结合成盐。在酸性环境中，氨基酸与酸结合而游离成阳离子；在碱性环境中，氨基酸与碱结合而游离成阴离子，所以它是一种两性电解质。改变溶液的pH值，可使氨基酸呈电中性，即带相等的正、负电荷数，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点，通常以pI表示。在等电点pH环境中，氨基酸既不游离成阳离子也不游离成阴离子，而是游离成为兼性离子。α－氨基酸可与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，此反应可用于氨基酸定量测定。芳香族氨基酸在280nm紫外线光谱处有最大吸收，可测定溶液中的蛋白质含量。

蛋白质的分子结构非常复杂，可概括为一级、二级、三级及四级结构。一级结构即是氨基酸借肽键连接成肽链的结构，是指肽链中氨基酸的排列顺序。二级结构是指多肽链中主链原子在各局部空间的排列分布状况，而不涉及各R侧链的空间排布。构成蛋白质二级结构的基本单位是肽键平面或称酰胺平面。二级结构包括α螺旋、β－折叠、β－转角和无规卷曲，主要靠氢键维系。三级结构包括蛋白质主链和侧链在内的空间排列。四级结构是指蛋白质亚基之间的缔合。三、四级结构主要靠次级键维系。

蛋白质的结构与功能关系密切。蛋白质的一级结构决定其空间结构。空间结构相似就有相似的生物学功能。一级结构是生物学功能的基础，不同种属来源的同种蛋白质的一级结构会有某些差异，这是进化的结果；但与生理功能密切相关的氨基酸不会改变。由一级结构改变，蛋白质的功能障碍引起的疾病称为分子病。蛋白质的功能多样性与其空间结构的复杂性密切相关。

蛋白质由氨基酸构成，因此一部分性质与氨基酸相同，如有两性电离和等电点，某些呈色反应等；但蛋白质是由氨基酸借肽键构成的高分子化合物，又不同于氨基酸的性质，如胶体性质，易沉降，不易透过半透膜，变性、沉淀、凝固等。根据蛋白质的两性电离特性和在等电点易沉淀的性质，可以用电泳法、等电点沉淀法、离子交换层析法、盐析法等分离和纯化蛋白质。在某些物理或化学因素影响下，蛋白质分子可发生变性或沉淀，变性并未破坏一级结构，因此在一定条件下仍有可复性。