紫外-可见分光光度法

光是电磁波，不同波长的光具有不同的能量。波长200～400nm为紫外光区，400～760nm为可见光区。物质吸收紫外和可见光区的电磁波而产生的吸收光谱称为紫外-可见吸收光谱。利用紫外-可见吸收光谱进行定性和定量分析的方法，称为紫外-可见分光光度法。紫外-可见分光光度法可用于药物的鉴别、检查和含量测定，是药品检验中应用非常广泛的一类仪器分析方法。

一、基本原理

分子的价电子吸收了光的能量，由低能量的基态转变为高能量的激发态的过程称为跃迁。产生跃迁的必要条件是光子所提供的能量正好与跃迁所需的能量相当，紫外光和可见光所具有的能量，恰好能满足电子在不同电子能级之间的跃迁。不同结构的物质分子能级差不同，可以产生不同的紫外-可见吸收光谱，据此可以对物质进行定性分析。

分子对特定波长光的吸收程度除了与分子的结构有关外，还与被测物质溶液的浓度有关。单色光穿过吸光物质溶液时，在一定的浓度范围内，被该物质吸收的光量与该物质溶液的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比。其关系式如下： 

                              A=-lg

式中，A为吸光度，T为透光率，E为吸收系数，C为被测物质溶液的浓度，L为液层厚度。

吸收系数E是物质的物理常数，随浓度C单位的不同，吸收系数E有不同的意义和表示方法。当C以“mol/L”为单位时，E称为摩尔吸收系数，用e表示；当C用“g/100ml”为单位时，E称为比吸收系数，用表示。在药品检验中使用比吸收系数（），简称吸收系数，其物理意义是当吸光物质溶液浓度为1％（1g／100ml），液层厚度为25px时，在一定条件（波长、溶剂、温度）下的吸光度。

从上式可知，在一定条件下，吸光度（A）与溶液浓度（C）和光路长度（L）成正比，这是紫外-可见分光光度法用于药物定量测定的根据。

二、紫外-可见分光光度计

（一）仪器的基本结构

用于紫外-可见分光光度法分析的仪器为紫外-可见分光光度计。紫外-可见分光光度计的基本结构如图所示。

紫外-可见分光光度计结构的示意图

1.光源  光源的作用是提供一定强度、稳定且具有连续光谱的光。紫外光区通常采用氢灯或氘灯，可见光区采用钨灯或卤钨灯。

2.单色器  单色器的作用是将来自于光源的复合光色散成按一定波长顺序排列的连续光谱，并从中分离出一定宽度的谱带。色散元件是单色器最重要的组成部分，早期的色散元件主要是棱镜，近年来由于光栅可方便地得到高质量的、分布均匀的连续光谱而被广泛采用。

狭缝是单色器的又一重要部件。狭缝的宽度直接影响到单色光的谱带宽度，宽度过大，单色光的纯度差，宽度过小，光强度减小，检测灵敏度降低。

3.吸收池  吸收池又称比色皿，用于盛装样品溶液或空白溶液，以进行测定。吸收池应选择在测定波长范围内没有吸收的材质制成。玻璃能吸收紫外光，所以玻璃吸收池不适用于紫外光区的测定，仅适用于370nm以上的可见光区；石英吸收池既适用于紫外光区的测定，也适用于可见光区，但由于价格较贵，通常仅在紫外光区使用。

4.检测器  常用的检测器有光电池、光电管或光电倍增管等。它们都可将接受的光信号转变为成比例的电信号，信号再经过处理和记录就可以得到紫外吸收光谱或吸光度的测定值了。

（二）仪器的校正和检定

1.波长  为保证测定结果的准确性，《中国药典》规定，除定期对仪器进行全面校正和检定外，还应于测定前对波长进行校正。这是由于温度变化对机械部分的影响，使仪器的波长经常会有所变动。常以汞灯中的几根较强的谱线或用仪器中氘灯的特定谱线为参照进行校正；钬玻璃因其在特定的波长有尖锐的吸收，也可做波长校正使用，但需注意，不同来源的钬玻璃可能有微小的差异。

2.吸光度的准确度  吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液来检定。取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L的硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，在规定的波长处测定吸光度，计算吸收系数，与表5-1规定的数值相比，应符合规定。

3.杂散光的检查  杂散光是一些不在谱带范围内且与所需波长相隔较远的光，一般来源于光学仪器表面的瑕疵。杂散光的检查方法是配制一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠溶液，在杂散光影响比较显著的波长处测定透光率，不得大于规定值。

  仪器检定用重铬酸钾硫酸溶液的吸收系数

杂散光检查用试剂、浓度、波长及要求

三、吸光度的测定

为保证吸光度测定的准确性，《中国药典》对吸光度的测定有以下一些要求。

1.溶剂  测定供试品的吸光度通常是配成溶液后测定，所用溶剂除能充分溶解样品、与样品无相互作用、挥发性小外，在测定波长处的吸光度也应符合要求。溶剂的检查的方法为：将溶剂盛装在25px厚的石英吸收池中，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质），测定其吸光度，溶剂和吸收池的吸光度在220~240nm范围内不得超过0.40，在241~250nm范围内不得超过0.20，在251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上时不得超过0.05。

2.作空白试验校正  吸光度的测定实际上是透光率的测定，透过光强度的减弱不仅是供试品吸收所致，还与溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等有关。因此测定吸光度时均应采用空白校正的方法，以扣除其他因素的影响。将配制溶液用溶剂（空白溶液）装入与样品池相同（或配对）的吸收池里，置入光路中，调节仪器，使吸光度为0，或透光率为100％，然后测定样品溶液的吸光度，此时的吸光度即为供试品的吸光度。

3.测定波长的检查  为提高测定方法的灵敏度，减少测定误差，吸光度的测定一般在最大吸收波长（  max）处。为了核对供试品吸收峰的位置是否正确，除另有规定外，采用25px的吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸光度（同时做空白对照），吸收峰波长应在该品种项下规定波长的±2nm以内，并以吸光度最大的波长作为测定波长，否则应考虑供试品的真伪、纯度及仪器波长的正确性。

4.供试品溶液的浓度  溶液浓度的选择主要考虑应使吸光度在0.3~0.7范围内，因在此范围内吸光度测定的相对误差较小。应根据药物的吸收系数，将样品溶液配制为适宜的浓度。

5.仪器狭缝宽度的选择  若仪器狭缝宽度过大，单色光的纯度变差，可使测得的吸光度降低。狭缝宽度的选择以减少狭缝宽度时，供试品溶液的吸光度不再增加为准。

四、在含量测定中的应用

紫外-可见分光光度法用于药物含量测定的方法有四种：

1.对照品比较法  分别配制供试品和对照品溶液，在规定波长处分别测定吸光度，按下式计算供试品溶液中被测组分的浓度。

CX=（AX/AR）CR

式中，CX、CR为供试品溶液和对照品溶液的浓度，AX、AR为供试品和对照品溶液的吸光度。

对照品比较法可以在一定程度上克服测定条件对结果的影响，测定时，供试品溶液和对照品溶液的浓度及测定的条件应一致。

2.吸收系数法  按各品种项下方法，配制供试品溶液，在规定波长处测定其吸光度，再根据吸收系数按下式计算供试品溶液的浓度。

                                                            C=

使用吸收系数法测定时，对仪器必须进行严格的校正和检定，如波长的准确度、狭缝宽度等必须符合要求，否则会影响测定结果的准确性。

3.计算分光光度法  本法系将分光光度法测得的吸光度进行适当的数学处理，以获得供试品中待测物的量，如双波长分光光度法、导数光谱法等。计算分光光度法主要用于消除样品中干扰组分的干扰。

4.比色法  供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定，这种方法称为比色法。 

用比色法测定时，由于显色时影响的因素较多，应取供试品与对照品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的试剂，并用同样方法处理，在规定的波长处测定吸光度后，按对照品比较法的公式计算供试品溶液的浓度。