视频1：破坏脑髓和脊髓

视频2：坐骨神经干标本制备

 低温、局麻药对蟾蜍坐骨神经干动作电位传导速度和不应期的影响

 【实验目的】

1．知识目标：通过学习本实验，能熟练掌握生物电记录的一般原则和方法。

2．技能目标：能熟练应用细胞外电刺激诱发神经干动作电位，并正确应用BL-420生物信号采集与处理系统记录神经干复合动作电位。

3．素质目标：提高学生综合分析、解决问题的能力和实践动手的能力，增强学生团队协作能力。

【实验原理】

神经纤维静息时，处于细胞内负外正的电位差，即静息电位。将两个刺激电极与神经干接触，当刺激器发出脉冲刺激时，负电极处发生去极化，去极化达阈电位时爆发动作电位，使负电极处发生内正外负的倒极化，使已兴奋的电极处电位低于邻近未兴奋处而出现电位差而产生局部电流。此局部电流依次扩布引起整个神经纤维的兴奋。依据这样的原理推论，发出刺激脉冲时，细胞膜发生去极化兴奋的部位在负电极处，而正电极处则发生膜的超极化。这样就造成两电极间存在电位差。而且随着兴奋在神经干的扩布，放置在膜外的两电极可记录出电位差的动态变化。如图6-1所示。本实验方法为细胞外记录法。若把微电极插入细胞内可记录下单细胞动作电位，此法叫细胞内记录法。两种方法记录下的动作电位的波形有所不同。

本实验对象是蟾蜍离体坐骨神经干。它由众多的神经纤维组成。因此，当给予神经干一个电刺激时，刺激强度不同会引起一个至多个纤维兴奋，记录电极会把多个动作电位同时记录下来，形成的动作电位图形，称为复合动作电位。复合动作电位表现出许多不同于单纤维动作电位的特点，它可作为神经干兴奋的标志。

【材料与方法】

一、实验动物：蟾蜍（身长约375px）

二、器材、药品：蛙类手术器械一套。包括：蛙板、刺蛙针、玻璃分针、锌铜弓、眼科剪、眼科镊（直、弯）、手术剪、中式剪刀、组织镊。神经标本盒、滴管、培养皿、任氏液、丝线。BL-420生物机能实验系统。

三、方法与步骤

（一）坐骨神经干标本制备（见第三章第七节“坐骨神经干标本制备”）

（二）准备好神经标本屏蔽盒，向盒内注入少量任氏液，将神经搭载于盒内电极上，神经中枢端置于刺激电极一侧，外周端置于引导电极一侧，神经干应与每个电极密切接触，神经和电极上不能有液滴。然后盖好盒盖，使神经封闭，防止神经干燥。

（三）仪器连接：如图6-2所示

图6-2  仪器连接示意图

（四）测量指标：阈刺激强度、动作电位潜伏期、时程，峰一峰值、不应期。

（五）动作电位的诱发、记录及参数测量方法

1．引导、记录及观察坐骨神经干复合动作电位。

（1）将1通道的输入线连接神经标本盒的r1、r2及接地接线柱，进入BL-420界面，按以下提示操作：

用实验模块时：实验项目®肌肉神经实验®神经干动作电位引导。

不用实验模块时：输入信号®1通道®动作电位；

手工设置刺激参数见下表（参考值）               

（2）记录复合动作电位波形。

（3）实验结果存盘后反演，测量动作电位潜伏期、时程及正、负双相波幅和峰-峰值（每一参数值取10个以上计算平均值）。

2．测量神经干动作电位的传导速度。

（1）用身长约375px的蟾蜍制备坐骨神经干标本。

（2）在步骤1基础上，添加一对引导电极（r3、r4），r3、r4与S1、S2刺激电极间距离尽量远一些。输入信号®1通道®动作电位；输入信号®2通道®动作电位。

（3）在BL-420界面上，按以下提示操作：

用实验模块时：实验项目®肌肉神经实验®神经兴奋传导速度测定

不用实验模块时：根据实验原理，分别测定电极r1-r3之间的距离（S）和兴奋从r1传导到r3需要的时间（T），求得传导速度v=S/T。

（4）增快显速，仔细观察是否能出现相继多个动作电位。

3．测量坐骨神经干兴奋性恢复周期，按以下提示操作：

（1）在记录电极r1、r2之间用组织镊夹伤神经干。

用实验模块时，实验项目→神经肌肉实验→神经干兴奋不应期测定。

不用模块时，刺激参数设置见下表（参考值）               

（2）分别测量不同波间隔时，AP1与AP2幅值，测出不应期。

【实验结果】

1．剪辑、打印记录曲线

2．绘三线表填入刺激器、放大器、显速等参数及阈刺激、最适刺激、动作电位幅度、时程、传导速度、不应期等数据。

【注意事项】

1．制作标本过程中，应尽量减少对神经的牵拉，以免损伤神经。

2．实验过程中，要保持标本湿润，不时向神经干上滴任氏液，但要用任氏液棉球吸掉过多的水珠，以防电极短路。

3．始终保持神经干与电极密切接触。神经干不可折叠。

4．实验有干扰时，应注意使用BL-420系统提供的50HZ抑制功能。

5．实验结束后，应清洗、擦干标本盒及电极，防止电极腐蚀。

实验流程：          

【要求与思考】

1．课前应熟悉第二章第七节内容。

2．复习相关的基本名词、概念（时值、强度、时间关系曲线等。）

3．若加大记录电极与刺激电极间距离，BL-420系统显速足够快时，可记录出相继的数个动作电位，试说明其原因和意义？

4．刺激电极的正负极哪一个应靠引导电极一侧？你可以交换刺激电极正负极位置重复实验，观察阈刺激和潜伏期有无差别，为什么？

5．根据所学的电生理实验基本知识，若神经干燥、受牵拉对实验结果的影响及其机理。

6．本实验测得的不应期是绝对不应期还是有效不应期？为什么？本实验方法能否测得相对不应期、超常期？为什么？

7．参阅第五章第一节，了解乏极化电极的制作。

【作业题】

1．如何鉴别生物电信号与干扰信号？

2．阐明神经干双相动作电位产生的原理。

3．分析比较神经干的复合动作电位与微电极细胞内记录的单根神经纤维动作电位的区别与相互关系。

4．总结利用刺激器诱发组织兴奋的一般方法。

5．比较利用刺激器诱发神经干复合动作电位与单纤维动作电位的刺激方法有何不同。