一、实验原理

人体外周血小淋巴细胞，通常都处于间期的Go或G1期，一般情况下不进行分裂。在体外适宜培养条件下，经植物凝集素（Phyto-hemagglutinin，PHA）的刺激，可转化成淋巴母细胞，重新进入增殖周期。当体外培养至72小时左右时，多数淋巴细胞已处于第二个增殖周期内，此时用有丝分裂的阻断剂秋水仙素（colchicine）处理一段时间，可使分裂的细胞停止在中期，再经低渗、固定、滴片等步骤，即可获得大量的可供分析用的中期染色体。人体的1ml外周血内一般含有约1.0×106~3.0×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备用，故该方法在国内外的实验室中以及临床上被广泛应用。

 

二、材料、试剂与器材

1、材料：人外周血

2、试剂：

⑴培养基：含RPMI1640、10%~20%小牛血清、植物凝集素PHA、谷氨酰胺、青链霉素等。

⑵肝素溶液：取安瓿装肝素注射液（含12500单位）1支，用25ml无菌生理盐水在超净工作台中稀释成500单位/ml的稀释液。使用时每毫升血加0.2ml肝素液（100单位肝素一般可抗凝5ml血）。若购得的肝素为粉剂，可配成4mg/ml的浓度，由于每毫克含125单位，故浓度也是500单位/ml。

⑶秋水仙素液：称取秋水仙素5mg溶于100ml 0.85%的NaCl中，配制成50μg/ml的原液，再用生理盐水稀释成5μg/ml的工作液，置于棕色瓶中，4℃冰箱中避光保存。使用时，每5ml培养基用5号针头加2滴（约0.05ml，相当于0.25μg），使培养基中秋水仙素的终浓度达0.04～0.08μg/ml左右。

⑷ 0.075mol/L KCl低渗液：称取5.593克KCl溶于1000ml蒸馏水中。

⑸ 固定液：甲醇：冰醋酸＝3：1现配现用。

⑹1/15mol/L磷酸缓冲液：称取Na₂HPO₄·12H₂O 11.81克（或Na2HPO₄·2H₂O 5.92克）、KH₂PO₄·12H₂O 4.50克溶于1000ml蒸馏水中，用NaHCO₃调至pH6.8。

⑺ 5.0％NaHCO₃溶液：称取NaHCO₃ 5.0g，溶于100ml双蒸水中，待完全溶解后，高压蒸气灭菌，4℃冰箱内保存备用。

3、器材：超净工作台、培养箱、恒温水浴箱、干燥箱、离心机、2ml注射器、5ml刻度离心管、吸管、量筒、试管架、冰载玻片、消毒用酒精棉球与碘酒棉球等

 

三、内容与方法

㈠培养淋巴细胞（无菌操作）

1、采血：用5ml一次性注射器抽取肝素0.2ml（500单位/ml）湿润管壁，然后将多余的肝素打出，常规消毒肘部皮肤，从肘部静脉采血2ml。

2、接种：垂直将注射针直接穿过培养瓶的橡皮塞，向5ml培养基中滴加18滴全血，轻轻摇匀。

3、培养：将培养瓶置于37℃恒温箱内培养72小时。培养期间，定期轻轻摇匀，使细胞充分接触培养基。

4、秋水仙素处理：终止培养前2小时，在培养液中加入秋水仙素（用1ml注射器套上5号针头滴加2滴，使终浓度为0.02μg/ml）。轻轻摇匀后，继续培养2小时，以收获更多的中期分裂细胞。

㈡染色体制备

1、收获细胞：取出培养瓶，用吸管吸取培养物，移至5ml刻度离心管中，混匀，在粗天平上平衡后放入离心机，以1200r/min离心10分钟，吸弃上清液，留沉淀物0.3ml。

2、低渗处理：往离心管中加入预温至37℃的0.075mol/L的KCl至4.5 ml，用吸管吹打混匀，置于37℃恒温水浴箱中低渗30～40分钟，促使细胞膨胀，染色体分散。

3、预固定：沿管壁缓缓加入0.5 ml（10滴）新配制的固定液并混合均匀，平衡后放入离心机，以1200r/min离心10分钟，吸弃上清液，留沉淀物0.3ml。

4、固定：加入新鲜固定液至5ml，用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打混匀成细胞悬液，室温固定20分钟，平衡，1200r/min离心10分钟，吸弃上清液。

5、再固定：加入5ml固定液，用吸管轻轻吹打使细胞混匀，室温下静置20分钟或更长时间，1200r/min离心10分钟，吸弃上清液。

6、制备细胞悬液：视离心管中细胞（沉淀）的多少加入0.3~0.4ml左右的固定液，用吸管轻轻打匀制成细胞悬液。

7、滴片：取预冷的冰载玻片一张，用吸管吸取细胞悬液以20~750px的高度滴3~4滴于玻片上，立即将玻片放在酒精灯火焰上来回过几下，在空气中晾干。

8、染色：如果所制备的标本用于染色体的非显带分析，则将晾干的玻片标本用Giemsa染液（用1份Giemsa原液加9份pH6.8的磷酸缓冲液混合而成）在染色缸中染色15~20分钟。然后在自来水管下用细水轻轻冲洗，晾干后镜检。

㈢注意事项

1、采血时，注意不要使用太多的肝素，因为肝素过多会抑制淋巴细胞的转化，但也不宜太少，否则易出现凝血现象。如果培养物中出现膜状凝块，可轻摇培养瓶使凝块散开。

2、培养温度应严格控制在37±0.5℃，培养基最适合的pH值为7.2~7.4之间，偏酸时细胞发育不良，偏碱时细胞会出现轻度固缩。

3、注意盖紧培养口，以免培养过程中培养液的pH值发生较大变化。如果培养液变黄，说明偏酸，此时可加入无菌的2%NaHCO3溶液或另加2~3毫升培养液进行调整。

4、秋水仙素的浓度和时间应随实验的要求而异，若从能得到足够量的中期分裂相考虑，秋水仙素的处理时宜长些，所用的浓度宜高些；但从能得到较为细长的染色体（分带方便）考虑，处理时间宜短些，所用浓度宜低些。

5、低渗使红细胞破裂，淋巴细胞膨胀，低渗时间的长短关系到染色体分散的好坏。固定应彻底，吹打要均匀，用力过猛会引起细胞膜破裂，染色体丢失。

6、固定液在使用前临时配制。

7、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。

8、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；离心速度太低，细胞易丢失。