一、实验原理

70年代初期，Matter和Schmid首先建立了一种哺乳动物骨髓细胞微核出现率来检测染色体损伤的新方法，称之为微核测定法。当染色体受到损伤以后，细胞在有丝分裂后期，丧失着丝点的染色单体或染色体断片，到末期被子细胞核所排除而形成次核，游离于细胞质中。在间期细胞中，常常见到比普通细胞核小得多的一个或几个圆形结构。其直径大约相当于细胞直径的1/20～1/5，故称微核。在骨髓和外周血的有核细胞中均可见到。但是，在这类只有少量胞浆的有核细胞中，微核常难以与正常核叶及核的突出物相鉴别。而无核的嗜多染红细胞的胞浆中，微核却十分易于辨认。故此一般检查嗜多染红细胞中微核的多少来鉴别是否异常。微核实验是评价理化因子对机体遗传危害的一种快速筛选方法。

 

二、材料器材

1、成年小白鼠，体重在22～25克（雌雄均可）、年龄以30天～35天为佳

2、器材：5毫升尖底刻度离心管、吸管、解剖剪、镊子、5毫升注射器、6或7号针头、载玻片、盖玻片、立式染缸、吸水纸、显微镜、离心机等

 

三、试剂

1、环磷酰胺母液：称取100mg环磷酰胺溶解在5ml的生理盐水中，配成20mg/ml的溶液。环磷酰胺工作液：用时将环磷酰胺母液稀释成5mg/ml即为工作液

2、小牛血清：滤菌后血清，放入56℃水浴保温半小时进行灭活，冰箱保存

3、0.9%NaCl（生理盐水）

4、Giemsa染液原液：

   Giemsa粉  1.0g            纯甘油   66ml           甲醇   66ml

    称Giemsa粉末1.0g置于研钵中，加少量甘油充分研磨，呈无颗粒的糊状。再将全部甘油加入（加入的甘油总量为66ml）。放入56℃中温箱中2h，然后加入66ml甲醇，混匀保存于棕色瓶中。一般2周后使用为好。

   Giemsa工作液：用时每9毫升0.1M磷酸盐缓冲液（PH6.8）加入1毫升Giemsa原液。

5、0.1 M磷酸缓冲液（Sorensen配方）

6、6.0 mmol/L磷酸缓冲液（PH6.8）

 NaH₂PO₄·12H2O           11.81 g   （或者 NaH₂PO₄·2H2O    5.92 g）

       KH₂PO₄·12H2O             4.50 g

溶解于1000 ml蒸馏水中，用NaHCO₃调至PH6.8

 四、内容与方法

骨髓细胞微核测定的取材时间为给药后24小时较为合适。阳性药物可用环磷酰胺，为加强阳性效果，剂量适当加大，如145毫克/仟克体重。给药途径视实验要求而定。

1、骨髓液的制备：（4人共用1只小鼠，2人共用1根股骨）

用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖，取出股骨，剔净肌肉，用自来水洗净股骨上的血污和肌肉，剪去股骨两端。在离心管中加5毫升生理盐水，用5ml注射器吸取生理盐水，针头插入骨髓腔，将骨髓冲入离心管中，可反复从股骨两端冲洗，直至股骨变白。然后，用吸管反复吹散离心管中的骨髓细胞。

2、离心：以1000转/分离心5分钟，然后用吸管吸去上清液。在留下的沉淀中加1滴灭活小牛血清，用吸管尖端仔细混匀，即制得混悬液。

3、涂片：每人吸取混悬液1小滴于载玻片的一端，按血常规涂片（应稍厚），约3厘米长，在空气中晾干。

4、固定：把干透的涂片放入无水乙醇中固定5-10分钟。即使当日不染色，也应固定后保存。当日染色效果较好。

5、染色：用Giemsa工作液染色18～20分钟，然后，开大自来水冲洗2秒。

6、观察计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分散均匀，细胞无损，染色良好的区域，然后再转到油镜下进行计数。

骨髓中含有多种细胞，有的有细胞核，有的无细胞核。在无细胞核的细胞中较易看到微核。正常情况下，嗜多染红细胞和成熟红细胞都为无核细胞，前者呈蓝灰色，后者呈桔红色，前者比后者稍大、稍厚。

微核大多数呈圆形或椭圆形，每个细胞中可有1个或数个微核，其边缘光滑整齐，嗜染性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。一个嗜多染红细胞中出现二个或更多个微核，仍按一个细胞计数。

正常小白鼠嗜多染红细胞微核率为千分之2.59±0.41，按145毫克/仟克剂量给小鼠腹腔注射环磷酰胺，其嗜多染红细胞微核率为千分之30.36±3.81。即正常小鼠嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常。