《最后的晚餐》是画家费时三年为米兰的格拉齐圣母修道院的餐厅所作的壁画。内容取材于《圣经》上犹大出卖耶稣的传说故事。据传说耶稣曾在耶路撒冷的神殿上，猛烈抨击伪善的人，说他们是毒蛇的子孙，因此遭到这些人的极端仇视，他们决定处死耶稣。耶稣的门徒犹大在恶势力面前叛变，出卖了耶稣。在逾越节（犹太民族的主要节日）的晚上，耶稣已预知其死期将至，和12个门徒共进晚餐。而这幅画着重刻画的就是耶稣的门徒在听到耶稣说：“你们中有一个人要出卖我了”的一刹那所表露出来的不同的神色、表情的反应。
画面上，达·芬奇通过门徒们各自不同的手势、表情，分别表现出了他们惊恐、愤怒、怀疑、剖白和慌张的情绪，深刻地刻画出了他们的内心世界。比如：老雅各布极度愤慨，摊开双手，身子后仰，表现出极大的不可思议；多马举着食指向上，稳定着情绪，仿佛在说:这怎么可能呢？做贼心虚的犹大则双手紧握着钱袋，惊恐地斜视着基督，身体略微向后仰，下意识地想要逃跑；而约翰则优柔地把头垂在一边，搭拢双手，神志焦灼，不知如何是好；巴多罗买张开双手，显得震惊而又沉着，似乎是要大家不要惊慌等等。
这幅画的构图并不复杂，基本上是在一条直线上穿插变化的，但单纯中见丰富。特别是巧妙的构图和独具匠心的布局，使画面上的厅堂与生活中的饭厅建筑结构紧密联结在一起，使观画者感觉画中的情景似乎就发生在眼前。而且，画家不是照搬生活中围坐就餐的布局，而是让人物一字排开，都坐在桌子一边，面向观众。这一创造性构图，使画面更加集中，更加完美，更具有形式美，并且起到了突出主题的作用。画中的十三个人物有机地组合在一起，既有区别又有紧密联系，既突出了基督的主要形象，又层次分明地刻画出了每一个人的外貌和性格特征。
在空间及远近法的处理上，画家巧妙而又精确地运用了透视法则，把一切透视都集中在耶稣头上，在视觉上使他成为统辖全局的中心人物。在光和影的处理上也颇新颖，他利用建筑物的光源，耶稣背后窗口透进来的阳光，使耶稣和众门徒沐浴在夕阳的余辉下，照在耶稣头上形成了自然的圣光，而使犹大的脸部处在黑暗的阴影之中，以此来表示正义与邪恶的势不两立。
这幅宏大的壁画，严整、均衡而富于变化。整体上看构思精巧，情节紧凑，典型人物塑造得逼真、生动，表现手法极为高超，体现了画家精湛的绘画才能。《最后的晚餐》具有极高的艺术价值，是世界美术宝库中最完美的典范性杰作之一，是名副其实的艺术瑰宝。