实验一　血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

目的

了解电泳法分离血清蛋白质的原理，掌握醋酸纤维薄膜电泳法的操作方法及临床意义。

原理

血清蛋白质的等电点大都在pH　7以下，故在pH　8.6的缓冲溶液中都带有负电荷，在电场中向正极泳动。因血清各种蛋白质等电点不同，带负电荷量的多少不同，加之各种蛋白质分子量大小也各有差异，所以在同一电场中泳动速度快慢不等。带电荷多分子量小者，泳动速度快，反之则慢。用醋酸纤维薄膜作支持物进行电泳，可将血清蛋白质分为五条主要区带，从正极端起依次为清蛋白、α₁、α₂、β和γ－球蛋白。再经染色、洗脱和比色，即可算出各部分蛋白质的相对百分含量。

试剂

1.巴比妥缓冲液（pH　8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）　称取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g，加蒸馏水约500ml，加热溶解，冷至室温后，加蒸馏水至1　000ml。

2.氨基黑染液　称取氨基黑10B0.5g，加入冰醋酸10ml、甲醇50ml及蒸馏水40ml，混匀。

3.漂洗液　取95%乙醇45ml、冰醋酸5ml及蒸馏水50ml，混匀。

4.氢氧化钠溶液（0.4mol/L）

5.透明液　取冰醋酸20ml和无水乙醇80ml混匀。装入试剂瓶中塞紧备用。

器材

电泳仪、分光光度计、醋酸纤维薄膜、滤纸、培养皿、剪刀、镊子、加样器或盖玻片、直尺、玻璃板、铅笔、试管、试管架、吸量管等。

操作

1.薄膜的准备　将醋酸纤维薄膜切成2cm×8cm大小，在无光泽面的一端约1.5cm处用铅笔划一直线作为点样位置。将薄膜无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲溶液中，待完全浸透，即薄膜已无白斑后取出，加在滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液。

2.点样　取少量血清置于玻璃板上，用加样器取血清2～3μl均匀地加于点样线上，待血清渗入膜内后，移开加样器。应使血清形成具有一定宽度、粗细均匀的直线。

3.电泳　将薄膜点样的一端靠近阴极，无光泽面向下，平整地贴于电泳槽支架的滤纸桥上，使其平衡约5分钟，打开电源开关，调节电压为130～160V，电流为0.4～0.6mA/cm膜宽，通电40～50分钟，使电泳区带展开约3.5cm即可关闭电源。

4.染色　用镊子小心取出薄膜，浸入染色液中染色3分钟，然后取出，浸入漂洗液中反复漂洗数次，直至背景颜色脱净为止。一般每隔5分钟左右换一次漂洗液，连续漂洗3次即可。此时即得5条蛋白色带，从正极端起依次为清蛋白、α₁、α₂、β和γ－球蛋白。

5.定量　由于定量操作较为复杂，同学们实验操作只做前面四步即可。

正常值

清蛋白：57%～72%　　　α₁－球蛋白：2%～5%　　　α₂－球蛋白：4%～9%

β－球蛋白：6.5%～12%　　γ－球蛋白：12%～20%

临床意义

1.慢性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，γ－球蛋白升高2～3倍。

2.肾病综合征时，清蛋白降低，α₂及β－球蛋白升高。

3.结缔组织病（如红斑狼疮、类风湿性关节炎等）时，清蛋白降低，γ－球蛋白显著升高。

4.多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，γ－球蛋白升高，并于β和γ区带之间出现“M”带。

思考题

1.电泳实验时应注意哪几个关键环节？

2.醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白依次分为哪几条区带？