第三节　胚胎干细胞

胚胎干细胞(ES细胞)是从早期囊胚内细胞团经体外培养、分离、克隆得到的具有发育多能性的细胞。ES细胞具有以下特点:①体外培养可以无限增殖;②可以长期保持原始未分化的状态;③可以分化成为衍生于3个胚层的各类组织细胞，包括生殖细胞。

一、ES细胞的获得

ES细胞获得方法并不局限于取自内细胞团这一种方法，实际上，一些早期胚胎细胞可以重新获得多分化能力，如小鼠卵黄囊细胞可以在体外诱导分化称为多能性干细胞。目前获得ES细胞的方法主要有以下3种:①人多能干细胞可以取自体外受精胚胎囊胚期内细胞团细胞(图11-1);②人多能干细胞可以取自终止妊娠的胎儿原始生殖嵴组织(图11-1);③取自去核卵细胞经体细胞核移植后产生的融合细胞进一步分裂发育成囊胚，再取其内层细胞培养形成多能干细胞(图11-2)。

图11-1　利用体外受精获得囊胚的内细胞团或流产胎儿原始生殖细胞产生多能干细胞

图11-2　利用动物核移植技术获得杂合细胞发育成的囊胚获得多能干细胞

受精卵发育到囊胚阶段，外表是一层扁平细胞，称为滋养层，可以发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称为囊胚腔，腔内一侧的细胞群被称为内细胞团。内细胞团在进一步形成内、中、外3个胚层时开始分化，每个胚层将分别分化形成组成人体的各种细胞，由这些细胞构成各种组织器官，形成完整的个体。内细胞团发育成完整的个体，必须要有滋养层细胞的存在，脱离了滋养层细胞，内细胞团不能发育成一个完整的个体。因此这些细胞被认为具有多能性，而并不像受精卵那样具有全能性。将囊胚中的内细胞团通过免疫外科法或机械切割法分离出来，接种到制好的饲养层上，用合适的培养基，并添加白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)。几天后将离散长成的集落接种到新的培养基上，再过几天后挑选干细胞集落进行传代，可获得胚胎干细胞系(图11-3)。

图11-3　ES细胞系的获得方法

二、ES细胞的主要特征

ES细胞都具有相似的形态特点，与早期胚胎细胞相似，细胞较小，核质比高，细胞核明显，有一个或多个核仁，染色质较分散，细胞质内除游离核糖体外，其他细胞器很少;体外培养细胞呈多层集落状生长，紧密堆积在一起，无明显细胞界限。ES细胞、EG细胞的染色体均为稳定的二倍体核型(图11-4)。

ES细胞为未分化的多能性细胞，它表达早期胚胎细胞、畸胎瘤细胞的表面抗原。Oct-4为目前广泛用于鉴定ES细胞是否处于未分化状态的一个重要的标记分子。观察发现，它最早表达于胚胎8个细胞时期，一直到细胞发育至桑葚胚时期。在每个卵裂球中都可检测到大量的Oct-4的表达产物，这之后Oct-4的表达局限于内细胞团细胞。由此可见，Oct-4为细胞是否具有多能性的一个标记分子。ES细胞表达包括SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4等种属阶段性胚胎细胞表面抗原(stage-specific embryonic antigen，SSEA)。另外，还有一些其他的标记分子，如碱性磷酸酶、Genesis、TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM-2和CD30等。端粒酶具有反转录酶的活性，正常体细胞缺乏此酶。细胞每分裂一次，端粒即减少50～100bp，以致细胞逐渐衰老;而ES细胞端粒酶持续高水平表达。因此，这些细胞在分裂后保持端粒长度，维持细胞的不死性。肿瘤细胞的永生性也与端粒酶的存在直接相关。

图11-4　体外培养的ES细胞

注:可见细胞排列紧密，呈山丘状生长(照片由成国祥提供)

三、ES细胞的分化潜能

Thomson等将从囊胚分离的5个ES细胞分别注入患严重联合性免疫缺陷的棕色小鼠皮下，每个小鼠都产生胚胎组织瘤。瘤组织包括胃(内胚层)、骨和软骨组织、平滑肌和横纹肌(中胚层)、神经表皮、神经节和复层扁平上皮(外胚层)，证明了人ES细胞具有分化为外、中、内3个胚层的能力，可分化产生多种组织细胞。对于ES细胞的多能性还可利用大鼠胚胎干细胞的3个试验证实:①体内分化。将胚胎干细胞注射到严重免疫缺陷小鼠的皮下或肾囊中，在注射部位可形成畸胎瘤。检测畸胎瘤组织可观察到来源于3个胚层的不同的细胞类型。②体外分化。若采用悬浮培养，将抑制ES细胞分化的因素去除后，ES细胞先形成类胚体(embryoid body，EB)，类胚体中包含3个胚层发育形成的多种细胞类型。③嵌合体的形成。将供体的胚胎性干细胞注入受体胚泡中，然后转移到假孕母体子宫中进一步发育，可得到嵌合体动物(图11-5)。该动物身体中既可观察到供体的组织细胞，又有受体的组织细胞，即嵌合体动物的各种组织器官是由供体的ES细胞和受体胚泡共同发育而来。

图11-5　嵌合体小鼠的生成

注:利用来源于C57BL/6J小鼠(黑色)的ES细胞，注射到ICR小鼠(白色)的囊胚中，移植到ICR假孕受体母鼠子宫中，最终产出毛色黑白镶嵌的嵌合体小鼠(照片由成国祥提供)

从表11-1可以看出ES细胞的生物学特征在不同种属哺乳动物之间存在很大的差异，以上所建ES细胞系中，只有小鼠ES细胞具有生殖系嵌合能力，猴ES细胞没有生殖系嵌合能力，人ES细胞由于伦理道德的约束无法进行胚胎嵌合实验。因而从严格意义上讲，只有小鼠ES细胞能称之为ES细胞，而其他动物ES细胞只能称为类ES细胞。

表11-1　小鼠、猴、人ES细胞的生物学特点

注: TRA为肿瘤拒绝抗原(tumor rejection antigen)。

四、ES细胞增殖与分化的分子机制

ES细胞增殖含有两层意思:一是分裂扩增;二是保持未分化状态。

小鼠ES细胞体外培养时，需要LIF来维持其增殖状态。LIF作用于质膜上的白血病抑制因子受体(leukemia inhibitory factor receptor，LIFR)gp130异源二聚体，使JAK激活，继而磷酸化LIFR和gp130上的酪氨酸残基，gp130上的酪氨酸残基被磷酸化后，有两条信号传导途径与ES细胞的增殖相关:一是可激活STAT3转录因子，促进ES细胞增殖;另一条途径是激活各细胞中广泛表达的磷酸酯酶SHP-2，SHP-2与底物Gab1结合，激活ERK信号途径，抑制ES细胞增殖，促进ES细胞分化。实验表明STAT3激活是ES细胞增殖必不可少的，而SHP-2/ERK信号途径对ES细胞增殖起间接或负调控作用。

ES细胞研究的另一个主要目的就是按照人的意愿来控制人的ES细胞株和EG细胞株向特定的细胞转化，并将这些转化的细胞应用于临床治疗。目前，研究人员在ES细胞的定向分化中已取得了很大的进展，如已可以使人的ES细胞定向分化为神经元、心肌细胞、血管内皮细胞、类胰岛细胞等。很显然，人们一旦掌握了ES细胞定向分化的规律，必将引起生物医学领域的一场重大革命。

对于ES细胞定向分化的策略就是改变细胞的微环境。目前主要从3个方面进行:一是在体外培养时改变培养条件，包括向培养基中加入不同种类的生长因子及化学诱导剂，如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β¹(TGF-β¹)、肝细胞生长因子(HGF)、神经生长因子(NGF)等，维A酸、二甲基亚砜(DMSO)则是最常用的化学诱导剂。不同的生长因子和化学诱导剂可单独或配伍使用，诱导物不同，干细胞的分化方向亦不同。另外，可以使干细胞与其他细胞一起培养，并加入不同类型的细胞来诱导细胞分化。二是通过转染或其他方法导入外源性基因来激活细胞的特化分化，但必须在明确导入基因定向分化的方向，且选择合适的导入时间及准确导入位置的条件下才能达到细胞的定向分化目的。目前，已有这方面成功的报道。三是体内的定向分化，体内的定向分化是将ES细胞移植到动物体内的某一部位，在体内微环境中，干细胞诱导分化为该部位相应的特异性细胞。如Deacon等将小鼠ES细胞直接移植到帕金森病(Parkinson disease，PD)大鼠模型的心脏和纹状体，成功分化为相应的心肌细胞和神经元。

五、ES细胞的应用价值及前景

(一)干细胞是研究早期胚胎发育的良好模型

单细胞的受精卵是如何形成一个完整个体的，这是一个在胚胎生物学研究领域中由于涉及伦理等方面的问题而一直不能深入研究的课题。只有阐明胚胎发育机制，明确各种先天缺陷的原因，并从中获得纠正其发生的途径，才能对各种先天缺陷进行有效预防ES细胞作为研究胚胎早期发育的模型。ES细胞系的建立，首先解决了长期悬而未决的早期胚胎模型问题。实验研究发现，通过对ES细胞的体外培养，将人的ES细胞悬浮培养，可生成胚体。胚体内包含内、中、外3个胚层，这同胚胎早期发育极其相似。采用基因芯片技术，比较ES细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录与表达，可以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题，因而人ES细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中极早期事件的良好材料和方法。在此过程中分离鉴定各种关键的基因及蛋白质分子，并对早期胚胎发育机制进行研究将会带来突破性的进展。

(二)干细胞是研究人类疾病的良好模型

对于各种人类疾病的研究，往往需建立疾病的动物模型来探讨发病机制及影响因素，以寻求预防治疗疾病的方法及途径。许多疾病的研究因缺少有效的体外模型而进展缓慢，如艾滋病、丙型肝炎，其致病病毒只能在人类及黑猩猩的细胞中才能生长，这就限制了对该病的研究;而ES细胞的出现即可解决这些问题。因为干细胞具有分化为体内各种组织细胞的潜能，研究者可根据不同疾病，利用干细胞建立相应的疾病模型，进而更深入地研究疾病的发生机制及影响因素，以寻求最佳的治疗、预防手段。

(三)干细胞的临床应用

小鼠ES细胞体外可以分化成各种体细胞，其分化能力几乎等同于内细胞团。1998年11月，Thomson在Science上报道，他们已获得具有无限增殖并具有多向分化能力的人ES细胞。理论上在一定的诱导条件下，可将人ES细胞分化成某一类群的细胞，并将这些细胞移植到有某种疾病的患者体内，替代发病的细胞，从而治愈某种疾病(图11-6)。由于ES细胞可以无限增殖，因而可以获得大量的细胞用于移植治疗，从而有望解决目前细胞或器官移植治疗方面材料有限的矛盾。

图11-6　ES细胞移植治疗的模式图

用ES细胞进行移植治疗同器官移植一样也存在免疫排斥的现象。目前可以通过两种方法来避免免疫排斥:一是创建“万能供者细胞”，即敲除(knockout)或用患者主要组织相容性复合物分子(MHC)基因替换所建人ES细胞中的MHC基因，从而躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免疫排斥效应发生的目的;二是从患者身上任何部位取下一些体细胞，通过核移植技术，将其体细胞的细胞核显微注射到去核的人卵细胞中，这种包含与患者完全相同遗传物质的杂合卵细胞在体外发育成囊胚，从这些囊胚中分离人ES细胞，经诱导分化为某类体细胞。这种分化细胞理论上同患者的MHC完全相同，因而不会产生免疫排斥反应，此法又称治疗性克隆。对于患有先天性遗传方面的疾病，可先通过核移植方法获得同患者基因型相同的ES细胞，在细胞水平上通过遗传修饰，纠正ES细胞内引发疾病的基因，获得正常的ES细胞，再用于移植治疗，从而为基因治疗提供一个新思路。

(四)ES细胞的其他用途

由于ES细胞具有在体外高度增殖和多向分化的潜能，因此，可作为生物医学领域中非常重要的研究手段而被广泛应用。

ES细胞可用于转基因动物模型的建立，并可以结合基因敲除、基因功能获得性突变等基因重组技术，对特定基因进行功能性研究。用ES细胞作为基因载体生产转基因动物主要有两种方法:一种通过基因打靶技术，将目的基因同源重组进入ES细胞基因组，将携带外源基因的ES细胞注射到囊胚，获得生殖系嵌合动物，其后代个体中则含有目的基因，从而获得转基因动物。另一种可以通过夹心法，ES细胞在中间，同两个四倍体胚胎嵌合，发育到囊胚后移植到受体，四倍体细胞组成胎儿的胚外组织，而正常二倍体ES细胞则发育成胎儿。用整合有外源基因的ES细胞同四倍体嵌合也可以获得转基因动物。目前这两种方法在小鼠上已获得成功，通过同四倍体嵌合在牛上也获得成功。

利用ES细胞可以建立用于药物研制和筛选的动物模型。目前新药研究中细胞水平上的药物筛选只能在动物细胞株或人类异常细胞系，如癌细胞系上进行，很多时候这些细胞系并不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应;而ES细胞则可以经过定向分化获得药物研制和筛选所需的各类正常人体细胞，这为药物研究人员在细胞水平提供了一个新的研究手段，用于新药的药理、药效、毒理及药代动力学等方面的研究。

另一方面，ES细胞可以用于动物克隆。ES细胞可以无限传代增殖，而且不改变其基因型和表型的特点。以ES细胞作为核供体进行核移植，可以在短时间内获得大量基因型和表型完全相同的个体。目前体细胞克隆已经是一种成熟的技术，但体细胞克隆存在很大的缺点，供体核进入去核卵中后要重编程，重编程的结果直接影响克隆后代的健康。体细胞为高度分化的细胞，重编程的过程非常复杂。现在的体细胞克隆后代往往存在生理和免疫缺陷，而ES细胞为未分化的细胞，理论上讲，以ES细胞为供体，核重编程较为容易，因而可以获得健康的克隆后代。