实验二十一　姐妹染色单体交换标本的制备

姐妹染色单体交换（sister chromatid exchange，SCE）技术，是20世纪70年代继染色体显带技术之后，细胞遗传学研究中展现的又一技术。SCE是与DNA的损伤修复和DNA复制紧密相连的自然过程。如果在DNA复制过程中进行DNA损伤的修复，就有可能发生姐妹染色单体交换。

由于SCE比染色体畸变敏感，一时间成为评价染色体损伤修复的一项遗传学指标，广泛的应用于研究DNA修复不完全综合征，细胞周期动力学分析及检测致突变物质和致癌物质等领域。

利用SCE显示阳性的化学物常为致癌原或诱变剂的关系，SCE技术可作为一种快速、简便的检测突变致畸和致癌物的方法，如毒性检测，对实验动物体内和体外的毒性检测，也可对接触毒物的工人抽血做淋巴细胞培养，观察生产环境有害因素及环境因素对人体的影响。因此该技术已成为检测致突变物和致癌物的一种有效手段。

一、实验目的

（1）掌握人外周血淋巴细胞染色体SCE标本的制备技术。

（2）熟悉SCE标本的观察及分析方法。

二、实验原理

5－溴脱氧尿嘧啶核苷（5－bromodeoxyuridine，BrdU）是脱氧胸腺嘧啶核苷（deoxythymidine，TdR）的类似物。当人外周血淋巴细胞在含有BrdU的培养液中增殖时，BrdU可取代TdR而掺入到新复制成的DNA子链中，由于DNA的复制是以半保留的方式进行的，故当细胞经历了2个增殖周期后，其中染色体的2个单体的DNA双链在化学组成上便出现了差别，即一个染色体中的DNA的双股单链都掺入了BrdU，另一股则不含BrdU。由于双股都含BrdU的DNA分子具有螺旋化程度较低的特性，从而降低了与某些染色剂的亲和力，故当用Giemsa染料染色时，双股都掺入有BrdU的DNA分子所形成的染色单体着色较浅。而另一条染色单体由于所含的DNA分子仅有一股单链掺入了BrdU，可被Giemsa深染（图21－1）。

图21－1　姐妹染色单体的分化染色机制

注：1.复制前的DNA双股。2.在BrdU中第一次复制（虚线代表含BrdU的单股）。3.第一次复制结束。4.在BrdU中第二次复制，一条DNA双股均含BrdU（染色浅），另一条DNA只含单股BrdU（染色深）。

由于经过BrdU处理的细胞中染色体的两条姐妹染色单体的着色程度明显不同，假如姐妹染色单体出现了片段的交换就很容易被观察到。在互换处可见一界限明显、颜色深浅对称的互换片段。

三、实验用品

（1）材料：人外周血。

（2）器材与仪器：光学显微镜、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、20W紫外线灯、培养瓶、10ml刻度离心管、吸管、试管架、注射器（1ml、2ml）、酒精灯、载玻片、天平、小烧杯、染色缸、黑纸、擦镜纸。

（3）试剂：RPMI　1640培养液、PHA、肝素、2×SSC、500μg/ml的BrdU、pH　6.8磷酸缓冲液、Giemsa染液。

四、实验内容

（一）细胞培养（人类外周血淋巴细胞培养）

（1）接种：无菌抽取外周全血0.2～0.3ml（肝素抗凝），接种在5ml含有PHA的RPMI　1640培养液中，37℃培养箱培养。

（2）加BrdU：在培养24h加500μg/ml　BrdU液0.1ml，使培养液中BrdU终浓度为10μg/ml，混匀后，培养瓶用黑纸包瓶遮光，继续培养48h。

（3）加秋水仙素：在收获细胞前2～3h（即培养到69～70h）加秋水仙素（终浓度为0.2μg/ml培养液）

（二）收获细胞和制备染色体玻片

收获细胞及染色体标本制片均与实验十八相同。

（三）标本老化

将制好的染色体玻片置37℃培养箱48h，或在60℃干烤箱烤片2h。

（四）差别染色——紫外线照射法

（1）将老化好的染色体玻片标本放入一平皿中（最好用牙签放在玻片下面），在玻片上盖一张稍大些的玻片擦镜纸，使纸的四边垂于平皿中，滴加2×SSC液到纸上，使擦镜纸全部湿润，使平皿中放入的2×SSC溶液与玻片水平，保证有充足的2×SSC液渗至标本上，保持标本湿润。

（2）将平皿置于56℃的水浴箱中，使平皿底部接触水面。

（3）在水浴箱上架一支20W的紫外线灯，使灯管与标本的距离6cm左右，开灯照射30min。

（4）照射完毕，用镊子轻轻揭去擦镜纸，用自来水轻轻冲洗玻片。

（5）1∶10Giemsa染料染色5～10min（不要着色过深）。

（6）自来水冲洗晾干后即成SCE标本。光学显微镜下观察，选择在加入BrdU之后经过2个复制周期，姐妹染色单体分化着色清晰（图21－2），染色体分散良好，长短合适和染色数目完整的中期分裂相，进行观察分析。在进入第二次复制中期的分裂相中，清晰可见姐妹染色单体分染为一深一浅图像，可观察到姐妹染色单体同源片段等位交换相。

图21－2　姐妹染色单体差别染色

【SCE交换次数判定】

（1）染色体某臂端部交换算1次交换，臂间交换算2次；着丝粒处发生交换（需排除染色体在此发生扭曲）计一次。

（2）每个标本分析30～50个中期分裂相。

（3）SCE率计算：公式如下。

SCE率＝累计互换数/观察细胞数＝SCE/细胞

五、注意事项

（1）BrdU溶液最好现用现配，一次用不完，必须用黑纸（布）包裹避光，4℃冰箱保存。

（2）BrdU是强的致突变剂，使用浓度不易太高，在每毫升含25mg左右的剂量下不影响细胞增殖，在培养24h后加入均可。

（3）用紫外线照射诱发姐妹染色单体分化时，如紫外灯功率大，照射时间应相应减少。一般在20W的紫外灯与标本距离应在6cm左右；如果在15W紫外线灯照射时，距离标本应在4cm左右。温度要控制在50～60℃（冬天最好是55～60℃），但不应超过60℃。如果时间过长或温度过高都会造成染色体肿胀。

六、作业与思考题

计算样品的SCE率，分析该个体的染色体稳定程度。