实验八　细胞融合

细胞融合（cell　fusion）指在自然条件下或用生物的、物理的、化学的人工方法使2个或2个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生异种细胞的间融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于生物学和医学研究的各个领域，在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断和治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。如单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究和应用方面产生了重大影响。

一、实验目的

（1）掌握应用聚乙二醇（PEG）融合细胞的方法。

（2）了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。

二、实验原理

细胞融合的诱导物种类很多，常用的主要有灭活的仙台病毒（Sendai virus）、聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）和电脉冲。目前应用最广泛的是PEG，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚。

三、实验用品

（1）材料：鸡红细胞。

（2）器材和仪器：光学显微镜、恒温水浴锅、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻片、盖玻片、血细胞计数板。

（3）试剂：Alsever溶液、50%PEG（MW4　000）、1/5　000詹纳斯绿B溶液、GKN溶液。

四、实验内容

（1）从公鸡翼下静脉抽取2ml鸡血，加入盛有8ml的Alsever液的试管中，使血液与Alsever液的比例达1∶4，混匀后可在冰箱中存放1周。

（2）取0.2ml储存鸡血加入0.8ml的0.85%生理盐水，充分混匀，1 500r/min离心5min，弃上清液，加1ml的0.85%生理盐水，重复上述条件离心2次。最后弃去上清液，加0.8ml　GKN液，1 500r/min离心5min，弃上清液。

（3）加0.3ml的GKN溶液，制成细胞悬液（可用血细胞计数板计数，用GKN液将其调整为10⁶个/ml）。

（4）取0.2ml细胞悬液于1ml的EP管，置于37℃水浴中预热，同时将50%PEG液一并预热20min。

（5）将0.2ml的50%PEG溶液逐滴沿离心管壁加入到0.2ml细胞悬液中，边加边摇匀后于37℃水浴中保温20min。

（6）加入GKN溶液1ml，静置于37℃水浴中20min。

（7）1 500r/min离心5min，弃上清液；加GKN溶液1ml，1 500r/min离心5min，弃上清液。

（8）加GKN液少许，混匀，吸取细胞悬液于载玻片上，滴加1～2滴1/5　000詹纳斯绿B染液，用牙签混匀，染色3min，在显微镜下观察细胞融合情况。

（9）结果：在高倍镜下可以看到有2个或2个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞（图8－1）。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。

图8－1　鸡红细胞膜融合图

（10）计算细胞融合率：细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞，其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定，并统计分析。

在高倍镜下随机计数200个细胞（包括融合的与未融合的细胞），以融合细胞（含2个或2个以上细胞核的细胞）的细胞核数除以总细胞核数（包括融合与未融合的细胞核）即得出融合率。其公式如下：

融合率＝融合的细胞核数/总细胞核数×100%。

五、作业与思考题

绘制所观察到的鸡血融合细胞，并计算融合率。