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利用杂交瘤技术制备McAb的基本原理是:①淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种淋巴细胞克隆只产生一种抗体;②细胞融合技术所产生的杂交瘤细胞可以保持亲代细胞双方的特性;③利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb。

应用能够长期生长的骨髓瘤细胞(纯系小鼠腹水瘤型浆细胞，如X63、SP2/0等)和经抗原致敏，且能分泌某种抗体的淋巴细胞(免疫动物脾细胞)进行融合。该种融合的杂种细胞一方面具有骨髓瘤细胞在体外连续传代的能力，另一方面又继承了免疫细胞能大量合成、分泌特异性抗体的功能。这种融合的杂种细胞称为淋巴细胞杂交瘤。

1.试剂:优质小牛(或胎牛)血清、DMEM培养液、HT适应性培养基、HAT选择性培养基、50％PEG。

2.实验动物: 6～8周龄雌性BALB/c小鼠。

3.细胞:小鼠骨髓瘤细胞——Sp2/0细胞。

4.抗原:病毒、细胞或可溶性抗原。

5.仪器: CO₂细胞培养箱、超净工作台(或无菌间)、倒置显微镜、24孔塑料细胞培养板、50ml塑料离心管等。

1.杂交瘤细胞株的建立

(1)免疫BALB/c小鼠:病毒抗原: 50ug抗原(蛋白)与等量佐剂乳化后，腹腔或皮下多点注射，间隔4～5周注射第二次，1周后注射第三次。最后以同样剂量的抗原，经尾静脉加强免疫。3d后取脾。

可溶性抗原: 100ug与2×10⁸灭活的百日咳杆菌混合，腹腔注射4～6周后，用100～200μg抗原再免疫一次，3d后取脾。

细胞抗原: 2×10⁷细胞抗原鼠腹腔注射，2～3周后重复，共注射3次，3d喉后取脾。

(2)饲养细胞的制备(融合前一天):在体外细胞培养中，单个或少数分散的细胞不易存活与繁殖，必须加入其他活细胞才易存活与繁殖，这种加入的其他细胞称为饲养细胞。通常多用小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。

取正常BALB/c小鼠1～2只，拉颈处死，消毒后用小剪刀在小鼠腹部腹中线剪一横口，将皮肤向两边撕开，暴露出腹部。然后将5ml DMEM液注入腹腔诱聚腹腔细胞，用原来的注射器将注入的液体吸回，放入50ml离心管中，1000r/min离心10min，弃上清液，加完全DMEM液(约5×10⁶/ml细胞数)，按每孔0.1ml分装到96孔培养板。置37℃含5％CO₂培养箱过夜使用。

(3)骨髓瘤细胞悬液的制备:常用的骨髓瘤细胞系有2个，即NS-1和SP2/0。Sp2/0细胞本身不分泌任何免疫球蛋白或其组分，为应用最多的骨髓瘤细胞系。

用含20％牛血清的DMEM扩大培养Sp2/0细胞。融合的当天在倒置显微镜下挑选大小均匀、透亮、轮廓清楚、规则的瘤细胞，轻轻吹下，收集于50ml离心管中，1000r/min离心10min，用DMEM液悬浮细胞沉淀。台盼蓝染色检查活细胞数应大于95％，置37℃备用。

(4)免疫小鼠脾细胞悬液的制备(融合当天):取加强免疫3d后的BALB/c小鼠1只，拉颈处死，消毒后无菌取出脾脏，放入平皿内的200目钢网上，加入10ml DMEM液，用注射器芯将脾细胞轻轻挤压过网，即得脾细胞悬液，然后1000r/min离心10min，弃上清液，用DMEM液悬浮沉淀。细胞计数后冰浴备用。

(5)细胞融合:选分子量为4000U的PEG作融合剂，浓度为50％，过高浓度的PEG对细胞有毒性。在PEG的作用下，先引起细胞膜的融合，然后是核的融合。按细胞匹配法(2∶1～10∶1)，取1×10⁸脾细胞与1×10⁷骨髓瘤细胞混合于50ml离心管中，1000r/min离心10min，倾去上清液，轻弹管壁，使沉淀物混匀如糊状;在37℃水浴中加入0.7ml 50％PEG促进融合，边加边旋转，使细胞保持均匀状态，1min内加完;静置90s，立即在3～4min内缓慢加入20ml DMEM液以终止反应。室温800～1000r/min离心10min，弃上清液，于融合细胞沉淀管内加入含HAT的完全DMEM培养液20m l;按每孔0.1ml分装入备有饲养细胞的96孔细胞培养板内。置37℃，5％CO₂培养箱培养。

(6)融合细胞培养及观察:融合后，每3～5d用HAT选择培养液换液一次，连续2周;同时观察并记录杂交瘤细胞是否出现。2周后，改用HT适应性培养液。待杂交瘤克隆长至1/4～1/5视野时，进行阳性克隆的筛选。

2.杂交瘤细胞的筛选及鉴定

(1)阳性杂交瘤细胞株初选:杂交瘤细胞培养物的测定方法，可根据抗原的性质和需要的灵敏度来选择。如免疫荧光、酶标记免疫实验、放免测定、血凝试验、溶血空斑试验、抗体结合细胞制动试验等。

(2)阳性杂交瘤细胞克隆化:克隆化就是指通过适当的方法将所需单个细胞分离出来进行培养。获得单个细胞培养的方法，通常称为克隆化。细胞通过克隆化可获得单克隆细胞系，也可防止竞争淘汰和防止外来干扰。

现在已建立起来的克隆化方法有多种:显微挑选法、琼脂空斑法、琼脂分散法、有限稀释法等。有限稀释法的最大优点是克隆率特别高，几乎达100％。操作方法如下:①制备饲养细胞(方法同前);②杂交瘤细胞计数;③连续稀释:将杂交瘤细胞稀释到5～10个细胞/ml，再分别装入备有饲养细胞的96孔板，每孔0.1ml(约1个杂种细胞)。培养和观察同上。

(3)单克隆抗体Ig亚类鉴定:以分泌抗体的杂交瘤细胞培养上清液为抗原，与羊抗鼠Ig及Ig亚类分别作琼脂双扩散，观察有无沉淀线出现。

3.单克隆抗体的大量制备及纯化

杂交瘤细胞体外培养可得到的抗体效率有限，不能超过特定的细胞浓度，每天还要调换培养液，用体内杂交瘤细胞繁殖可消除这些限制。

(1)单克隆抗体的制备:将0.5ml降植烷(或液体石蜡)注射每只BALB/c系小鼠(腹腔注射)，7～10d后腹腔注射10⁷分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。经2～3周小鼠可产生实体瘤或腹水瘤，腹水增多。这时抽出腹水，置4℃3000r/min离心10min，取上清液检测抗体效价，分装，低温保存。

(2)单克隆抗体的纯化:虽然单克隆细胞培养物或腹水中具有高滴度抗体，对某些研究工作亦足够纯，但其中仍有许多无关蛋白，它们来自培养基、宿主或克隆化细胞本身。因此有必要进一步分离和纯化。常用的方法有硫酸铵沉淀法和免疫亲和层析法。

1.整个实验过程均应严格无菌操作。

2.制备饲养细胞时，注入和抽取腹腔液时，避开网膜，动作要轻，以免损伤肝、脾。

3.PEG的量为0.7ml，加终止剂的速度要均匀。

4.McAb筛选前，应提前选择稳定的方法，固定检测系统及试剂。5.换液时避免细胞克隆打散。