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以混合人血清免疫家兔，可获得兔抗人血清抗体。为使混合人血清能诱导家兔产生高效价特异性抗体，需添加佐剂。本试验采用弗氏完全佐剂，它可使抗原在体内缓慢释放，延长抗原在体内的停留时间，以获得较佳的免疫效果。

(1)健康家兔(体重2～2.5kg)。

(2)混合人血清。

(3)弗氏完全佐剂。

(4)无菌乳钵、滴管、注射器、9号针头、2.5％碘酒、75％酒精、无菌棉签等。

(1)混合人血清抗原的制备:选健康志愿者(学生)或献血员，静脉采血5ml;放试管中置室温下使其自然凝集，凝集后离心取上清液约2.5ml。将多人(至少2～3人，最好10人以上)的血清混合，即为可用的人全血清。将人全血清用生理盐水作1∶2～1∶5稀释。

(2)佐剂的制备:为了促进抗体产生，可在注射抗原的同时，加入一种辅助剂，这种辅助剂称为佐剂。佐剂一般是乳剂或悬液，当与水溶液中的抗原混合后形成一种油包水或水包油的乳状颗粒，这种颗粒延缓了抗原的释放，增加了局部刺激作用。抗原与佐剂同时应用，可促进抗原在淋巴组织中存留。佐剂本身可以有免疫原性，也可不具备免疫原性。常用的有免疫原性的佐剂有百日咳杆菌、革兰氏阴性杆菌的内毒素和抗酸杆菌(如结核分支杆菌)等;非抗原性的佐剂有铝乳、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、聚核苷酸、胞壁肽等。应用最多的是福氏(Freund)佐剂，是用石蜡油、羊毛脂和卡介苗混合而成。

福氏佐剂分为不完全佐剂和完全佐剂，称取羊毛脂12g，加液体石蜡20ml，高压蒸汽灭菌后即成为弗氏不完全佐剂。在弗氏不完全佐剂内加入一定量的死卡介苗，成为弗氏完全佐剂。佐剂和抗原的比例为1∶1。

(3)在弗氏完全佐剂中逐滴加入等体积的混合人血清，置于无菌乳钵中，朝一个方向研磨，每加1滴，都要研磨均匀后再加第2滴，直到乳钵内形成油包水的白色乳剂。将乳剂滴加于水中完全不散开时为合格。另一种方法是用两个5ml注射器，在接针头处用一尼龙管连通，一个注射器内是佐剂，另一注射器内为抗原。装好后来回推注，经多次混合逐渐变为乳剂。本法优点是无污染，节省抗原或佐剂，用此注射器可直接注射;缺点是不易乳化完全。乳化完全与否的鉴定方法是将一滴乳剂滴入水中，如立即散开，则未乳化好，如不散开漂在水面则为乳化完全。为了防止污染，有时在佐剂中加入抗生素。但抗生素有免疫抑制作用，如能注意无菌操作，就不必加入。

(4)将乳剂抗原吸入不带针头的注射器内，接上针头后，尽量排除空气，用无菌大试管套住注射器，于4℃保存。

(5)按附表10-1所示免疫程序进行免疫注射。

(6)末次注射后7～10d试血。用免疫兔耳缘静脉血血清为抗体，用生理盐水做不同倍数稀释;用12倍稀释的混合人血清为抗原。按照沉淀反应要求，做琼脂双向扩散试验，以测定抗体效价。效价达1∶32以上，即可心脏采血，分离并收获抗血清。

(7)做好标记，适量分装，－20℃冻存。

(1)选择动物时，动物种系与抗原来源的差异越远越好;动物应健康。处于青壮年时期。无特殊要求时最好为雄性。因有个体差异，故每种抗原最好免疫2～3只动物。

(2)本实验每个步骤都必须严格执行无菌操作，防止抗原的污染。

(3)菌液浓度可用比浊法调整。

(4)从耳缘静脉抽血前，最好先用二甲苯涂擦耳缘背部，使充血便于进针。助手必须捏住兔耳根直至抽血完毕。

(5)制备压积红细胞时，应无菌操作，避免剧烈振荡;试管应洗涤洁净，充分干燥，以免发生溶血。

(6)全血清作抗原时要用混合血清，以避免个体差异带来的误差。

(7)红细胞和细菌等颗粒性抗原比较容易诱导免疫应答，可直接用来免疫动物;而血清等可溶性抗原则需要加入免疫佐剂，充分乳化，否则不易免疫成功。

(8)免疫时采用皮内多点注射易诱导免疫应答，提高血清的抗体效价。

(9)免疫间隔时间无固定模式，但一般可溶性抗原首次免疫和第二次免疫以间隔10～20d为宜。

1.免疫血清制备的原理是什么?

2.试述免疫血清的应用。