【附录Ⅱ】　流式细胞术简介

一、概述

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种用流式细胞仪自动分析细胞的现代分析技术，其原理是悬浮在液体中的分散细胞一个个地依次通过测量区，当每一个细胞通过测量区时产生电信号，这些信号可以代表荧光、光散射、光吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存储、显示，于是细胞的一系列重要的物理特性和生化特性就被快速、大量地测定。

上述特性可以是细胞的大小、活性，核酸的数量、酶、抗原等。仪器还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个细胞群体中分选出来。流式细胞术在当前的细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、遗传学、病理学、临床检验学等各领域有着十分广泛的用途，具有速度快、敏感性高、准确性好等优点。流式细胞术是对悬液中的细胞或细胞器进行快速测定，可达每秒钟数千个乃至上万个细胞。这样，它就可与显微镜相互补充。显微镜术可以研究组织的结构、细胞定位和荧光在细胞中的分布;而多数流式细胞术是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的总核酸、总蛋白等而不能测量细胞中某一特定部位的核酸或蛋白，这是它的不足之处。

二、流式细胞仪的工作原理

将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统(透镜、光阑、滤片和检测器等)收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号，计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析。科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来，其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动，流动室即随之振动，使液柱断裂成一连串均匀的液滴，一部分液滴中包有细胞，而细胞性质是在进入液滴以前已经被测定了的，如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷，使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，完成分类收集的目的。

三、流式细胞仪的用途

流式细胞仪可用于细胞表面分子的检测与分析、细胞内或细胞核内抗原检测与分析、细胞凋亡与分析、DNA含量检测与细胞周期的分析、细胞增殖的检测与分析、细胞毒的检测与分析、可溶性蛋白分子的检测与分析、报告基因的检测和分析等。

四、流式细胞仪的技术指标

荧光分辨率:是表明仪器测量所能达到的最大精度，通常用变异系数表示。显然它与被其测定的标准样品有关。

荧光灵敏度:以能检测到最少的FITC分子来表示，即微球上最少标有多少个FITC分子时刚好能被检测到，即定义为荧光灵敏度。

前向角散射光灵敏度:以前向角散射光最小能检测到的颗粒直径表示。一般仪器能检测到的最小的直径在0.3um左右。

前向角散射光分辨率:以变异系数表示。一般约在2.0％。

分析/分选速度:分析速度可达每秒5000～10000个细胞，分选速度为每秒5000个细胞通过测量区。

分选纯度:分选纯度是比较复杂的问题，它不但与仪器精度有关，而且与被分选的细胞亚群在整个群体中的相对位置也有关系。如果被分选的亚群在直方图或二维点图上可清晰地分辨出来且与其他亚群无重叠，则分选结果的纯度就高，反之就低。

分选收获率:定义为通过测量区应被分选的细胞如果有100个，实际落到指定收集器中的数目为95个，此称为收获率95％。一般应在90％以上。收获率与分选纯度是呈负相关。

除以上7个参数外，还有样品浓度，同时可测参数、光源、喷孔尺寸、计算机配置等参数或指标。

五、常用的荧光素

FITC　　　异硫氰酸基荧光素　488

PE　　　　藻红蛋白　　　　　545

PI　　　　碘化丙啶　　　　　490

EB　　　　溴化乙啶　　　　　480

AO　　　　丫啶橙　　　　　　490

TRITC　　　四甲基若丹明　　　554

Texas Red　德州红　　　　　　355

六、标本制备方法

固定绿色荧光蛋白测细胞周期的细胞标本处理:

1. 0.25％胰酶消化贴壁细胞。

2. PBS洗涤1次，800r/min×5min离心，加入0.5％多聚甲醛固定(PBS稀释)，室温30min。

3. PBS洗涤1次，加70％乙醇(含3％血清)，放于－20℃。

普通细胞标本固定:

1.收获细胞(约1×10⁶细胞)。

2.细胞固定:用PBS洗涤细胞，800r/min离心，细胞重悬于100μlPBS，缓慢加入1ml 70％～80％乙醇，充分混匀。4℃过夜。－70℃保存(～1周)。

流式前细胞处理:

1. PBS洗3次。

2.加入荧光标记抗体anti-human CD34-FITC、anti-human CD45-FITC，4℃孵育30min，PBS洗去未标记抗体。

七、注意事项

1.流式细胞术的标本必须制备成单细胞悬液。

2.测定组织标本需用酶消化成单细胞或机械制备。3.流式细胞术需用新鲜的标本，未固定的组织。

【思考题】

1.什么是流式细胞术?

2.简述流式细胞术的用途。