实验23　SPA花环实验

(SPA rosette test)

【目的】

了解SPA花环实验的原理和方法。

【原理】

金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)是其胞壁抗原的主要成分，它能与大多数哺乳动物IgG分子的Fc段发生非特异性结合，而IgG分子中的F(ab) 2段仍能和相应抗原发生特异结合。因此，可将家兔(或羊)抗人免疫球蛋白(IgG)的抗体与金黄色葡萄球菌A蛋白结合，形成SPA-IgG复合物，用于检测人类B淋巴细胞表面的膜免疫球蛋白(SmIg)。在显微镜下见到的细胞膜上吸附有金黄色葡萄球菌的淋巴细胞即为B淋巴细胞。

【材料】

1.淋巴细胞悬液(制备方法见淋巴细胞分离技术)。

2.家兔(或羊)抗人免疫球蛋白(IgM及IgG)。

3.10％SPA菌体试剂。

4.Hanks液或pH7.2磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

5.小试管、吸管、载玻片、盖玻片、显微镜等。

【方法】

1.取兔抗人免疫球蛋白(IgM、IgG)血清0.1ml与1ml10％SPA菌体试剂混合，置37℃结合30min。

2.用Hanks液或PBS将与抗体结合的金黄色葡萄球菌重复洗涤2次。末次离心后，加Hanks液重新混悬为1ml，即为兔抗人Ig-SPA菌体试剂

3.取试管两只，标明为A(试验管)和B(对照管)。两管内各加淋巴细胞悬液0.1ml。再于A管内加SPA-IgG复合物0.05ml。B管内加未与抗体结合的金黄色葡萄球菌0.05ml作为对照。

4.混合均匀后，防4℃冰箱内15min。然后Hanks液洗3次，低速离心沉淀(500r/min)，每次10min。

5.末次离心后，吸弃上清液，仅留少量液体将细胞混匀。取细胞悬液1滴置于玻片上，覆以盖玻片，油镜下计数。亦可将细胞滴于玻片上，制成薄涂片，干燥后用甲醛固定，碱性美蓝或Wright氏染色后，油镜下计数。

【结果】

淋巴细胞周围吸附有20个以上菌体或细菌围绕细胞满圈状，即为B淋巴细胞。细胞悬液中有可能混杂有少量多核粒细胞，对葡萄球菌发生吞噬现象，在观察结果时应注意细胞的核型并加以区别。

正常参考值为12％～16％。

【思考题】

1.SPA花环实验的原理是什么?

2.SPA花环与E花环有什么区别?