实验16　免疫电泳

(Immunoelectrophoresis)

【目的】

掌握免疫电泳实验的原理及操作过程。

【原理】

免疫电泳(immunoelectrophoresis，IEP)是将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术。先将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异而彼此分离。然后在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫分散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准(或正常)抗原抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。

【材料】

1. 0.05mol/L，pH8.6，0.075mol/L巴比妥缓冲液，1％琼脂(用0.05mol/L，pH8.6的巴比妥缓冲液配制)。

2.抗原(人血清)、抗全血清抗体。

3.电泳仪、电泳槽。

4.指示剂(葡聚糖0.5g，偶氮胭脂红0.1g，巴比妥缓冲液20ml)。

5.其他物品:微波炉、水浴箱、载玻片、打孔器、吸管、微量加样器、适量滤纸和纱布等。

【方法】

1.将载玻片用水清洗干净后，再用少量75％的乙醇冲洗，晾干后备用。

2.将1％的琼脂融化后，置56℃水浴。

3.趁热用吸管取琼脂3.5ml，平铺于载玻片上，冷凝后按图形卡用打孔器打孔(图16-1)。

图16-1　免疫电泳琼脂板制作示意图

4.用微量加样器将抗原(血清)加入小孔中，再加入一小滴指示剂以指示电泳前沿。蛋白质含量应在20mg/ml以下。将琼脂板置于电泳槽内，两端用四层纱布搭盐桥。

5.通电，固定电压4～6V/cm长，通电30～60min。

6.电泳后从电泳槽中取出琼脂板，用刀片如图16-2所示挖一长形槽，挑去槽内琼脂，然后在槽内加入抗全血清抗体，勿使外溢。

7.将载玻片置于搪瓷湿盒内，置37℃温箱中扩散24～48h。

图16-2　免疫电泳扩散模式图A1b:白蛋白

【结果】

扩散后取出琼脂板，可观察到各弧形沉淀线形成。根据沉淀线的数量、位置和形状画图，必要时可按常规洗涤、染色。

【注意事项】

1.加全抗血清抗体时，注意勿外溢，溢出的样品必须用滤纸片吸去。

2.免疫电泳沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响。如抗原与抗体的比例，同其他沉淀反应一样，要预测抗体与抗原的最适比，又如抗血清的抗体谱，一只动物的抗血清往往缺乏某些抗体，如将几只动物或几种动物的抗血清混合使用，则效果更好。

3.免疫电泳突出的优点是分辨率高。可用该方法鉴定混合物中各组分的数目和性质。常见血浆蛋白各区带位置见图16-3所示:

图16-3　血浆蛋白免疫电泳图

PreALB:前白蛋白; HP:触珠蛋白;α₁脂蛋白; ALB:白蛋白; TRF:转铁蛋白βLIP:β脂蛋白; AAT:抗胰蛋白酶; AAG:酸糖蛋白;α₂M:α₂巨球蛋白

表16-1　血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分

【思考题】

1.分析还有哪些因素会影响免疫电泳沉淀线的数目和分辨率。

2.试讨论免疫电泳目前可应用于哪些方面(提示:如纯化抗原、抗体成分的分析、正常和异常体液蛋白的识别等)。