实验3　硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验

(Nitro blue tetrazolium(NBT) reduction test)

【目的】

了解中性粒细胞的硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验的方法和原理。

【原理】

细菌感染时机体正常的中性粒细胞能量消耗剧增、耗氧量增加、糖代谢活跃。因氧化还原反应，糖氧化过程中所脱的氢可被吞噬的或渗透到中性粒细胞胞质内的NBT染料接受，使淡黄色的NBT还原成蓝黑色的甲臜，以折光性强的点状或斑块状颗粒沉积于细胞内。镜下检查NBT阳性细胞数量，便可推知中性粒细胞的杀菌功能。

【材料】

1. NBT染液:取0.28gNBT加入100ml生理盐水，用超细玻璃滤器过滤，分装，4℃保存。

2. 0.77％沙黄O染液。

3.肝素:用无菌生理盐水配制25U/m l肝素溶液。

4.培养液:取0.5ml正常人血清加入0.3ml无菌生理盐水和0.6mlNBT染液。

5.甲醇、无菌生理盐水等。

6.碘酒与酒精棉球、温箱、凹玻片、湿盒、注射器、吸管等。

【方法】

1.取肝素抗凝外周静脉血0.1ml和培养液0.1ml加于凹玻片孔中混匀，置湿盒于37℃保温20min，中间摇动一次，再置室温15min。

2.取一滴混悬液于载玻片一端推成薄片，空气中快速干燥。

3.甲醇固定1～2min。

4.用0.77％沙黄O染液染色5min，水洗，干后油镜下检查。

【结果】

凡中性粒细胞胞质内含有斑点状或块状的甲臜颗粒沉积者为NBT阳性细胞，计数100～200个中性粒细胞，计数NBT阳性百分率。

【注意事项】

1. NBT染液应过滤，不要残留颗粒。

2.所用器皿应洁净，避免玻璃表面杂物参加NBT的还原作用。

3.单核细胞还原NBT的能力很强，在计算NBT阳性细胞时应除外。

【临床意义】

正常人参考值应在10％以下;全身细菌感染病人NBT阳性细胞在10％以上;病毒感染、无菌血症的局部感染或循环中无细菌产物(如内毒素)时，NBT值正常。慢性肉芽肿等吞噬细胞功能缺陷病无NBT阳性细胞，故可作为诊断该病的指标。