实验五　总糖和还原糖的测定(二)
——3，5-二硝基水杨酸法

【实验目的】

1．了解和掌握3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖的基本原理。

2．区分还原糖和总糖测定过程的异同，掌握具体的操作方法。

【实验原理】

还原糖是指含有自由基醛基或酮基、具有还原性的糖类。单糖都是还原糖。3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后可生成棕红色氨基化合物。在一定范围内，该棕红色化合物颜色的深浅与还原糖的量呈正比关系，可用分光光度计进行比色测定。因此3，5-二硝基水杨酸法可用于还原糖的测定，且具有简便、快速、灵敏度高、杂质干扰小的优点。

不具还原性的部分双糖或多糖经酸水解后可彻底分解为具有还原性的单糖。通过对样品中的总糖进行酸水解，测定水解后还原糖的含量，可计算出样品的总糖含量。

【实验材料】

甘薯淀粉。

【实验器材】

恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、玻璃漏斗、100 ml容量瓶、10 ml和100ml量筒。

【药品试剂】

1．3，5-二硝基水杨酸试剂(DNS):6．3 g DNS和262 ml 2 mol/L NaOH加入到500 ml含有182 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入5 g亚硫酸钠和5 g重蒸酚，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000 ml，储存于棕色瓶中，7～10天后使用。

2．1000μg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖1 g，加入少量水溶解后再加入8 ml12mol/L的浓盐酸，以蒸馏水定容至1000 ml。

3．6mol/LHCl。

4．10%NaOH。

5．6mol/LNaOH。

6．碘试剂:称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于蒸馏水中，定容于100 ml。

7．酚酞试剂:称取0．1 g酚酞，溶于250 ml 70%乙醇中。

【实验方法】

1．标准曲线的制作:

(1)标准葡萄糖梯度溶液的配制:取5支大试管，分别按表1-2加入试剂。

表1-2　　　　　　　　标准葡萄糖浓度曲线的制备

(2)绘制标准曲线:另取6支试管，前5支分别加入上述不同梯度葡萄糖溶液1 ml，第6管加入蒸馏水1 ml。然后各管再加入DNS试剂1 ml。沸水浴加热5分钟，取出冷却后再加入蒸馏水8 ml。摇匀，以第6管作为空白，分光光度计540 nm处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品中还原糖和总糖的测定:

(1)样品中还原糖的提取:称取甘薯粉1 g放入小烧杯中，先加入少量水调成糊状，再加入约50 ml水摇匀，煮沸约数分钟，使还原糖浸出，然后转移至100 ml容量瓶中定容，经过滤的上清液用于还原糖的测定。

(2)样品中总糖的水解和提取:称取甘薯粉1 g放入小烧杯中，加入6 mol/L HCl 10 ml，再加入水15 ml，搅匀后放入沸水浴中加热水解30分钟，冷却后用6 mol/L NaOH调pH值到中性(1滴酚酞试剂检测呈微红色)，然后转移至100 ml容量瓶中定容，过滤后，取10 ml上清液稀释至100 ml即为稀释1000倍的总糖水解液。

(3)还原糖和总糖的测定:分别吸取上述还原糖溶液和总糖溶液水解液1 ml于试管中，以制作标准曲线相同的方法加入DNS试剂1 ml，沸水浴加热5分钟，取出冷却后再加入蒸馏水8 ml，摇匀，分光光度计540 nm处测定吸光值。还原糖和总糖各做3个平行实验。

3．根据测定的吸光值，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，并折算成样品中还原糖和总糖含量。

含糖量=糖量(mg)×样品稀释倍数×100/样品量(mg)(%)

【思考题】

1．糖类物质包括哪些化合物?

2．为保证实验中糖测定的准确性，应注意哪些操作事项?