10．3．4　环境污染物毒性的评价方法

环境污染物的毒性是一个笼统概念。从不同角度研究外来化学物质的毒性，可用不同的研究方法。如传统的体外试验（in vitro test）和体内试验（in vivo test）。但近年来又分为免疫毒理学、遗传毒理学、呼吸毒理学、肝脏毒理学、肾脏毒理学、血液毒理学、神经毒理学和行为毒理学等。这些新的分类是以研究方法命名的，但大部分也可运用体内和体外试验方法。尽管研究方法千变万化，但最基本的研究方法仍是急性毒性试验、亚急性毒性试验和慢性毒性试验。环境污染物一般毒性评价采用体内试验方法，根据受试动物染毒时间的长短或次数分为急性、亚急性、亚慢性、慢性，以及长期和终生毒性试验。通过一般毒性试验，能够对环境污染物进行毒性比较，了解生物转运的特点，特别是吸收途径、半衰期、蓄积作用，掌握毒性作用的特征与性质，慢性中毒的可能性及其靶器官，急、慢性毒性效应的敏感指标，得出慢性毒性作用的阈剂量及无作用剂量，并可分析化学物质联合毒性效应、代谢转化、中毒机理及其影响因素。常规工作中，依据特定受试化学物质的要求和目的安排一般毒性评价的内容。

1．急性毒性试验

环境毒物的急性毒性试验是环境毒理学研究的最基本方法。急性毒性（acute toxicity）是指机体（人或实验动物）一次或在24h内多次接触外来化学物质之后所引起的中毒效应。此中毒效应可定在不同水平上，包括器官、系统损害，出现临床症状，甚至死亡。急性毒性试验（acute toxicity test）是通过给动物一次或24h内多次染毒，来测定半数致死剂量（浓度）、有效剂量（ED）、急性阈剂量（浓度），阐明剂量-效应关系与中毒特征，确定毒作用方式、中毒反应，提供受试化学物质的急性毒性资料，并为亚慢性和慢性毒性试验及其他特殊毒性试验的观察指标和剂量分组提供参考。

由于生物体所接触化学物质的质和量不同，受试动物发生中毒效应的速度和剧烈程度也不同，短者可在接触致死剂量几分钟内致受试动物死亡，长者要在几天后才出现明显中毒症状或死亡。另外，“一次”接触外来化学物质，也因外来化学物质理化性质、接触量、接触方式和途径不同而异。如为经口或经注射方式接触，“一次”是指在瞬间将外来化学物质输入受试动物体内。当然这个“瞬间”的长度也有差别。如果外来化学物质为气态或气溶胶状态且经呼吸道接触，“一次”是指在一个特定时间段内受试动物持续地接触外来化学物质。可见，“一次”是一个尽可能短的，因所接触化学物质不同、接触途径不同而异的时间段。

1）试验动物的选择

由于许多试验研究不能直接在人身上进行观察，因此动物试验就特别重要。由于动物对毒物的敏感性存在种属差异，动物试验的结果不能直接应用于人，但是根据人接触毒物的实际情况，用多种动物进行试验，可以预测毒物对人毒性作用的一般规律。选择受试动物一般以哺乳动物为主，常用大鼠、小鼠，也有豚鼠、金黄地鼠，特殊需要时也用灵长类。根据需要也可以选择某些昆虫（如蜜蜂）或水生生物（如鱼类）。此外，家兔常用于研究化学物质的皮肤毒性，猪用来估计化学物质经皮对人的危害较为理想。

在进行化学物质急性毒性试验时，应尽量选择对化学物质毒性反应与人近似，又易于饲养管理，试验操作方便，易于获得，单纯化又价格便宜的动物。对受试动物一般要求雌雄两性动物同时分别进行，每个剂量组两性动物数相等。一般选用初成年者，大、小鼠为生后2～3月左右，体重分别为200g和20g左右。受试动物喂养室温度应控制在（22±3）℃，相对湿度为30%～70%，无对流风。有条件的可以利用人工昼夜，早6点至晚6点进行12h光照，其余12h黑暗。每笼动物数量应有限，不干扰动物活动并对动物进行观察。若无特殊要求，动物食用常规试验室饲料，自由饮水。受试动物在喂养室内至少喂养观察一周，选取其中健康动物，体重差异在10%以内者，进行试验。

2）试验分组及剂量选择

正式试验前，一般都先用少数动物做预备试验，以求出受试化学物质使动物全部死亡和全部不死亡剂量范围。正式试验通常设五个以上不同剂量试验组，其中尽可能不包括全部死亡和全部不死亡剂量组。各组间剂量差距可按等差（即相邻两组的大剂量与小剂量之差相等）或等比（即相邻两组的大剂量与小剂量之比相等）级数设计。组距大小随毒物的毒性作用带宽窄而异，常按等比级数1．2～1．5设计，以期各剂量动物死亡率分布在50%上下。

3）染毒方法

人在生产和生活环境中接触环境化学物质的途径主要是经口、呼吸道和皮肤，所以在研究外来化学物质毒性时，一般常用的试验动物染毒方法，应依据人对化学物质的接触途径，外来化学物质的理化性质及其在环境中存在的形态等因素来确定，分别为经口染毒、经呼吸道染毒和经皮肤染毒。

（1）经口（胃肠道）染毒。

这一方法的目的是研究外来化学物质是否经胃肠道吸收并求出经口接触的半数致死剂量（LD₅₀）等。由于外来化学物质可以污染水和食物，因此，此种染毒方式在毒理学中占有重要地位。根据受试化学物质的理化性质，受试动物种属不同，又可细分为以下几种具体染毒方式。

①灌胃：将液态或固态、气态化学物质溶于某种溶剂中，配制成一定浓度，装入注射器等定量容器，经过导管注入胃内。染毒过程中动物口腔及食道上段不与受试化学物质接触。灌胃法的优点是剂量较准确，其缺点是工作量大，有损伤食道或误灌入气管的可能，而且和人正常经口接触化学物质方式差异很大。应用灌胃法时应注意，每一系列试验中同物种试验动物灌胃体积最好一致，这是因为成年试验动物的胃容量与体重之间有一定的比例。按单位体重计算灌胃液的体积，受试化学物质的吸收速度相对较稳定。小鼠一次灌胃体积在0．2～1．0 mL/只或0．1～0．5mL/10g体重为宜，大鼠一次灌胃体积不超过5mL/只。

②喂饲：将受试化学物质直接（或溶于某种溶剂）拌入饲料或饮水中，受试动物自行摄入。应单笼喂养动物，计算每日进食量或饮水量，折算拌入受试化学物质的剂量。尽管喂饲方式符合人类接触化学物质的实际情况，但当受试化学物质有异味、易挥发、易水解时，一般急性毒性试验还是应该尽量少用此法。

③吞咽胶囊：将一定剂量受试化学物质装入药用胶囊内，强制放到动物的舌后咽部迫使动物咽下。该方法剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异味的化学物质。家兔及猫、狗等大动物可用此法。

实施经口染毒时，受试动物应空腹，以防胃肠充盈影响化学物质的吸收和毒性。

（2）经呼吸道染毒。

许多化学物质在常温、常压下为气态，或在温度升高情况下蒸发为气态，还有些化学物质在生产过程和生活过程中以蒸气、气溶胶、烟、尘状态污染空气，有可能通过呼吸道吸入。因此，可通过经呼吸道染毒试验研究毒害机理，探讨吸入过程对呼吸道有无损伤及求出半数致死浓度（LC₅₀）等。

根据呼吸道染毒是“自然”的还是“被动”的可分为吸入染毒和气管注入染毒。前者是将受试动物置于含有一定浓度外来化学物质的染毒柜或其他容器中，动物自然吸入化学物质；后者是在受试动物被麻醉情况下，将已消毒无菌的外来化学物质（粉尘混悬液或液体）注入气管，使之分布于两侧肺中，这种方式一般用于制造急性中毒试验，而不用于急性毒性试验。

（3）经皮肤染毒。

几乎所有物理状态的化学物质都有接触皮肤的可能性，不少化学物质和皮肤接触后有被吸收的可能。皮肤为多层结构，外来化学物质只有穿透皮肤角质层到达真皮才能被吸收入血液。所以，研究外来化学物质经皮肤吸收是对角质完整的皮肤而言，经皮肤上毛囊、汗腺、皮脂腺吸收的化学物质量可以忽略不计。研究外来化学物质经皮肤吸收应尽量选择皮肤解剖、生理与人类近似的动物，较理想的是家兔和豚鼠，但因其价格昂贵，常用大鼠代替。

（4）经注射染毒。

采用注射途径进行外来化学物质的急性毒性试验，主要用于比较毒性研究，以及化学物质的代谢、毒性动力学和急救药物筛选等研究。注射途径可选择静脉（如大鼠、小鼠尾静脉，兔耳静脉等）、肌肉、皮下注射，小动物可用腹腔注射，但应控制注射液体积（表10-4）。

表10-4　几种动物不同注射途径注射剂量范围单位：mL

注：引自李国旗等，1999。

4）急性毒性反应的观察和检查

急性毒性试验主要测定半数致死量。观察动物中毒症状的出现时间、频率、表现特点，以及动物发生死亡的时间和死亡数，并进行病理检查，得出剂量-效应关系。观察时间一般为1～4天或一周，在某些特殊情况下可适当延长。观察期间，要特别注意动物的饲养和管理，以防止与外来化学物质无关的动物意外死亡情况发生。同时可根据受试动物的死亡时间计算半数致死时间LT₅₀，通常环境毒物剂量增大时，死亡时间缩短。靶器官的观察，可在染毒后短时间内的症状表现及死亡观察时间结束时，对存活生物进行病理检查，确定靶器官，而且阐明毒物的作用特点，提供急性中毒的急救依据，对亚致死急性毒性试验提出观察的重点。

5）半数致死量（LD₅₀或LC₅₀）的计算及毒性评价

测定LD₅₀（LC₅₀）可以有多种试验设计方法。所采用的试验方法不同，计算其LD₅₀（LC₅₀）的方法也不同。此外，同一种测定LD₅₀（LC₅₀）的试验方法，也可有多种计算方法。因此，试验前应根据拟用的计算方法进行相应的试验设计。目前常用的LD₅₀（LC₅₀）统计方法有概率单位法、最小二乘法、加权直线回归等。上述方法可在实际工作中根据受试化学物质及试验条件来选用，其具体的计算方法参考统计学专著。

评价急性毒性试验的结果时，应注意其结果不能作为全面反映受试化学物质毒性的特点，如有些受试化学物质，其毒性显得极小，但小剂量长期摄入时，可由于受试化学物质在体内具有明显的蓄积毒性作用等因素影响，表现出严重的毒性作用，或者一般毒性作用不明显，但可显示出特殊的毒性作用，如致癌、致畸和致突变等。因此，在进行外来化学物质的毒理学评价时，除进行急性毒性试验外，同时还须进行亚急性毒性、慢性毒性以及其他特殊毒性等试验，以便对受试化学物质的毒理学作用有较全面的认识。

水生生物急性毒性试验是评价环境污染物毒性的重要手段，对于控制工业废水排放已成为一种常规的监测方法。鱼和大型无脊椎动物常被用来进行96hLC₅₀的急性毒性试验，而某些无脊椎动物的半数效应反应，即EC₅₀试验更为普遍。水生生物的急性毒性试验设计与哺乳动物的基本相似。暴露试验可采用静态和动态的方法，pH值、溶解氧、硬度等指标必须符合渔业水质标准。

2．蓄积毒性评价

1）蓄积毒性

具有蓄积作用的外来化学物质，由于进入机体的速度或数量超过机体消除的速度或数量，使化学物质在体内不断积累，这种积累作用虽然不引起急性中毒，但若机体与此种小剂量的外来化学物质多次接触，一定时间后可出现明显中毒现象，称为蓄积性毒性。外来化学物质在体内的蓄积现象是亚急性和慢性毒性作用的基础。蓄积毒性是评价某些外来化学物质亚急性和慢性中毒的主要指标，也是制定卫生标准时选择安全系数的重要依据之一。其蓄积性的大小主要取决于化学物质进入机体的速度超过其体内消除速度的程度、每次接触机体的间隔时间、化学物质本身的性质和机体对此种物质代谢转化和排泄的能力。化学物质在体内的消除速度通常以生物半衰期表示。

外来化学物质在体内的蓄积包括物质蓄积和功能蓄积。当机体多次接触较小剂量化学物质时（每次接触的时间间隔应短于机体内消除该化学物质所需的时间），该化学物质的数量在体内不断蓄积，此种量的积累过程称为物质蓄积，又称量的蓄积。当机体反复接触化学物质后，机体的结构和功能发生改变，并逐渐加深导致中毒表现，称为功能蓄积。物质蓄积和功能蓄积是同时发生、互为基础的，对蓄积性毒物的这种蓄积方式的划分是相对的。

用化学分析方法测定滴滴涕及其代谢产物在人体脂肪组织中含量的动态状况，可直接观察毒物的蓄积过程。但有时毒物在体内的物质蓄积不能用现代分析方法查出，需要用生物方法进行鉴定，其中最常用的方法就是蓄积系数法。

2）蓄积试验

蓄积试验是检测外来化学物质在体内蓄积性大小的试验。其测定方法如下：每日给予动物相当于半致死量LD₅₀1/20～1/10剂量的受试化学物质，连续1个月，然后再给予剂量为LD₅₀的该化学物质，这时，如果动物死亡数超过50%，则可认为该化学物质在动物体内有蓄积作用，此法最简单易行。

（1）蓄积系数的测定。

蓄积系数（cumulation coefficient，Kcum）表示化学物质的功能蓄积程度，常用多次染毒所引起某种效应之总量ED₅₀（n）与一次作用时所得相同效应的剂量ED₅₀（1）之比来表示，即

试验一般用小鼠或大鼠。常用的观察指标有死亡和受试毒物对机体的特异性损害等。当以死亡率指标作为观察效应时，则

K_cum值的大小表示蓄积作用的强弱。K_cum越小，受试物质的蓄积性越大。按K_cum值的大小可将蓄积性分为四级：当K_cum＜1时，为高度蓄积；当1≤K_cum＜3时，为明显蓄积；当3≤K_cum＜5时，为中等蓄积；当K_cum≥5时，为轻度蓄积。

（2）蓄积率的测定。

测定蓄积率常用小鼠和大鼠。分成两组，每组50只，其中对照组按常规测定LD₅₀，蓄积组每日预给予相当于LD₅₀1/20的剂量一个月后，按常规方法测定LD₅₀。然后比较两组动物LD₅₀的大小，以估计毒物在蓄积组动物中的蓄积程度。如果预给予的毒物在一个月内全部失去作用，则一个月后测得的蓄积组LD₅₀与对照组动物间无显著差异；如果有一定量的毒物蓄积，则蓄积组动物的LD₅₀应比对照组动物的LD₅₀小相应的剂量。计算蓄积率的公式为

蓄积率越大，则环境污染物在体内的蓄积作用越强。

（3）生物半衰期的测定。

生物半衰期测定是应用化学分析或同位素示踪技术测定毒物进入机体后，在体内随时间变化的方法。外来化学物质进入机体后，由体内消除一半所需的时间，称为生物半衰期。该理化方法可以确定毒物的半衰期，可作为其物质蓄积的检测方法。

化学毒物在机体体内的蓄积与其在体内的消失速度、生物半衰期有关，生物半衰期短的毒物，则蓄积能力可能小，反之，其蓄积能力可能大。通常用测定化学物质在受试动物血液中的生物半衰期表示，即间接测定化学毒物在血液中的浓度降低50%所需的时间。方法是将受试化学物质从静脉注入受试动物体内，然后按一定时间间隔，连续多次测定该物质在其血液中的浓度，结果记录在半对数纸上给出直线图，然后按图解法求生物半衰期。

3．亚慢性毒性和慢性毒性评价

在生活环境和生产环境中，人类接触环境污染物的浓度或水平，通常是比较低的，发生急性中毒的可能性较小，而在长期低剂量的反复接触中会发生慢性中毒。有些化学物质具有慢性毒性而没有急性毒性或急性毒性极低。为了查明化学污染物的慢性毒性，可根据蓄积试验来初筛有无慢性毒性作用的可能，并且也有必要进行亚急性（或亚慢性）毒性试验，作为慢性毒性试验所需要观察的毒性效应指标的筛选，探明化学污染物对人类的慢性毒性危害。

亚慢性毒性作用（subacute toxicity）是指机体在相当于1/10左右的生命期间，少量、反复接触某种外来化学物质所引起的损害作用，亦称亚急性毒性作用。研究受试动物在其1/10左右生命期间内，少量、反复接触受试化学物质后所致损害作用的观测过程，称亚急性毒性试验或亚慢性毒性试验，亦称短期毒性试验，是慢性毒性的预试步骤。试验目的是在急性毒性试验的基础上，进一步观测受试化学物质对机体的主要毒性作用及毒性作用的靶器官，并对最大无作用剂量及中毒阈剂量作出初步确定。此外，亚慢性毒性试验的结果，也可为慢性试验设计选定最适观测指标及剂量提供直接的参考。但是，有时通过急性毒性试验或参考其他有关资料，已基本掌握受试化学物质欲通过亚慢性毒性试验弄清的毒性损害情况，此时可省略亚慢性毒性试验而直接进行慢性毒性试验，也有时可根据受试化学物质的实际使用情况，例如接触机会有限或使用剂量较小，不需要进行慢性毒性试验，只进行亚慢性毒性试验即可。

慢性毒性作用（chronic toxicity）是指外来化学物质在动物生命周期的大部分时间内或整个生命周期内持续作用于机体所引起的损害。其特点是剂量较低和时间较长，而且引起的损害出现缓慢、细微、易呈现耐受性，并有可能通过遗传过程贻害后代。慢性毒性试验亦称长期毒性试验，是指在试验动物生命的大部分时间或终生时间内，连续长期接触低剂量的受试化学物质的毒性试验，其主要目的是确定外来化学物质的慢性阈剂量（浓度）及最大无作用剂量。探明慢性毒性反应，并进一步探讨中毒机理，为制订受试化学物质在环境中的最大容许限量和每日容许摄入量提供依据。因此，慢性毒性试验在环境毒理学的实验研究中具有重要的作用。

亚慢性毒性试验和慢性毒性试验在实验设计、观察指标等具体要求方面基本上无差异，主要是试验期限不同。亚慢性毒性试验一般进行3～6个月，如啮齿动物一般为1～3个月。对仅进行亚慢性试验而不需进行慢性试验的受试化学物质，持续时间则可稍长，一般为6个月。慢性毒性试验的期限，目前尚无统一标准。实际工作中，除致癌试验等特殊毒性试验外，一般情况下，试验期限采用6～12个月即可。毒性实验表明，中毒病理改变大部分均在6个月内出现。试验期限过长，动物年老后病理变化复杂，可能会干扰毒性试验的结果。故一般主张小鼠的试验期限为4～5个月，大鼠和家兔为12～18个月，狗为12～24个月。

1）试验设计

（1）试验动物的选择。

试验动物的选择，应考虑其对受试化学物质的代谢过程的生理反应和生化特性基本与人相似，且其来源方便，易于饲养管理。按照试验要求，采用的动物应有一种啮齿（大白鼠或小白鼠）和一种非啮齿动物（狗或猴），至少用一种动物全面系统地进行。最常用的动物有大白鼠、家兔、狗等。每组试验动物数量，必须满足统计学上的要求。由于试验持续时间较长，受试期间难免会出现与毒物无关的死亡，为保证试验结束时仍有足够数量（不少于10只）的动物供检查观察，试验期间，动物最好采用单笼饲养，各组动物的饲养条件应力求一致。

（2）染毒剂量和受试化学物质给予方式。

亚慢性毒性试验的剂量选择，应当使动物在试验期间不致很快死亡，而中毒症状却能明显发展，各系统、器官和组织出现一定的功能障碍和病理变化。一般采用1/5～1/80的LD₅₀剂量范围设3～4个剂量组和1个对照组。

慢性毒性试验的剂量，可根据急性和亚急性毒性资料来确定。一般共设4～5个剂量组和1个对照组，其中高剂量组应使受试动物引起明显中毒反应，但剂量又不能太高。低剂量组应使受试动物在整个试验期间不出现明显中毒反应，按1/10、1/50、1/100和1/1000的LD₅₀剂量作为分组标准，如受试化学物质有明显的蓄积作用，可适当降低试验剂量。

染毒途径应当参考与人类实际接触的方式。受试化学物质主要通过食物和饮水被摄入体内，气体和挥发性物质采用吸入法摄入。

（3）观察指标。

在亚慢性毒性和慢性毒性试验中，选用的观察指标基本相似，通常包括以下几种。①健康状况及生长发育的观察，包括一般表现、中毒症状观察、体重增长、摄食量、活动能力和死亡率等。②生物化学指标的观察。生物化学检查的项目种类繁多，主要包括肝功能的检查，特别是有关酶类活力的测定，以及肾功能的生化检查及尿常规检查。在进行肝肾功能检查时，亚慢性毒性试验可在试验前、接受受试化学物质后的第3天、第10天开始进行，以后可每隔20天以及试验结束时各进行一次测定，也可减少为在开始与结束各进行一次。试验期间可定期或不定期从每组随机选出一部分动物来进行测定。慢性毒性试验期间，每隔3～6个月进行一次测定即可。③血液指标测定，主要包括白细胞的计数测定、血红蛋白测定、白细胞分类计算项目测定及受试化学物质对动物某种血液特殊作用效应的测定。亚慢性毒性试验中，尽可能在试验开始前和结束时，对所有动物各测定一次，而试验过程中，可每隔1～2个月随机选出一部分动物进行一次测定。慢性毒性试验每隔3～6个月测定一次。④生物材料中毒物及其代谢物的分析。生物材料中受试化学物质及其在体内代谢的分析测定，是观察受试物质在动物体内吸收、分布、代谢和排泄的情况，以及有害物质在体内的蓄积，对探讨毒物作用的机理等有重要意义。生物材料的检测样品，一般包括血液、尿、粪及各种器官组织。其中除器官和组织样品外，其他样品均可从整体动物中反复采样取得，进行动态观测。血液和尿是最有代表性的生物样品，它们在较大程度上反映了机体对毒物的吸收率及吸收量、代谢率和代谢途径、排泄率和蓄积情况等。对器官和组织中的受试化学物质和代谢产物的含量测定，可了解受试化学物质在体内的蓄积部位和受试化学物质与作用点的关系，为研究毒性作用机理提供直接依据。⑤病理组织学检查及脏器系数的测定。动物病理组织学的检查，是亚慢性和慢性毒性试验中最重要的观察指标之一。病理组织检查，首先应进行肉眼观察，注意各内脏器官有无异常，特别是对直接接触毒物的器官及解毒、排泄器官，如消化道、肝、肺、肾、淋巴腺、眼、皮肤等要注意观察。为发现中毒过程不同发育阶段的病理改变及其发生、发展规律，可在实验期间分批分期杀死一部分动物进行病理检查，到实验结束时再全部处死剖检，为进一步探讨受试化学物质毒性作用机理提供重要线索。

检验结果的分析评价，必须是同样实验条件下与同年同龄动物对照组作比较，并作统计处理。

2）亚慢性毒性和慢性毒性试验结果评价

亚慢性毒性试验是对受试化学物质进行毒性研究的一个重要阶段，特别是对一些未知毒性的新化学物质，通过试验可了解受试化学物质的毒性作用特点和部位，鉴定受试化学物质是否具有蓄积作用，为慢性毒性试验提供试验设计依据。如果发现受试化学物质毒性较大，就不必进行慢性毒性试验。通过慢性试验结果可确定受试化学物质的安全剂量，但就此对受试化学物质的毒性作出全面评价显然是不够的。因为它未能反映受试化学物质可能对生物体遗传、生殖机能等的影响。同时亚慢性、慢性毒性试验，常常限于某一种动物和某一种染毒途径，其试验结果若直接类推到人类会出现很大偏差。因此尚须进行致癌、致畸、致突变等其他试验，以检测这些特殊毒性作用的特性，为全面评价受试化学物质毒性提供依据。

4．化学致突变作用

1）基本概念

突变（mutation）是指生物体的遗传物质出现了突然的、根本的、可以察觉并可遗传的变化。从现代基因理论的观点出发，只有起源于基因和染色体的变异才能遗传，可遗传的变异即称为突变。物质引起遗传物质发生突变的能力称为致突变性（mutagenicity）。某些化学物质引起生物体的遗传物质出现了突变效应，则称为化学致突变作用（chemical mutagenesis）。突变发生之后，可形成具有不同于亲代遗传性状的生物体，称为突变体（mutant）。凡能引起遗传物质发生突变的物质，统称为致突变物（mutagen），也称为致突变原、致突变剂等。有些化学物质本身并不能引起突变，必须经体内代谢活化，其代谢产物才具有致突变性，这类物质称为前致突物（promutagen）。

生物体在自然环境中的生存过程可能发生一定的变异，突变可以是自发的，其发生频率极低，物种的进化与自发突变有密切关系。后来人们发现化学物质也能引起基因突变，即诱发突变（induced mutation）。大量事实证明，某些遗传疾病可能来自外界因素的作用，即与诱发突变有关，如肿瘤的发生就与诱发突变相关。至今，化学物质损伤遗传物质已毫无疑问，并且已查明许多环境污染物具有这种能力。凡具有损伤遗传物质能力的化学物称为遗传毒物（genotoxic agent），遗传物质受损出现的不可逆改变称为突变。

突变从发生的方式讲，可以分成自然突变和诱发突变两种。诱发突变是由已知的化学、物理、生物等因素所致的突变；自然突变是在自然条件下发生的突变，是由于普遍存在的未知因素作用的结果。诱发突变和自然突变的本质相同，但诱发突变的发生频率较自然突变为高。

2）化学致突变的类型和机理

突变可分为基因突变（gene mutation）和染色体畸变（chromosome aberration）两大类型。基因突变亦称为点突变（point mutation），是染色体上一个基因或几个基因发生改变，属于基因水平的变化，不能用光学显微镜直接观察，必须用理化或生物学方法才能检出。染色体畸变是整个染色体的结构或数目发生变化，用显微镜可以直接观察。事实上，这两种突变类型并无本质区别，仅为程度之分。

（1）基因突变。

基因突变的机理是在致突变物作用下，DNA中碱基对的化学组成和排列顺序发生变化，根据作用方式和所引起的后果不同，基因突变又可分为以下几种类型。

①碱基置换（base substitution）：主要是由一些碱基类似物或碱基改造剂所引起的。参与DNA组成的碱基有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。正常情况下，DNA的多核苷酸链上的碱基配对结合有一定的规律，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）配对，而且碱基的排列有一定的顺序。由于化学致突变物可引起DNA多核苷酸链上一个或多个碱基的构型或种类发生突变，使其不能按正常规律与其相应的碱基结合配对，因而引起DNA多核苷酸链中碱基配对的异常，即碱基置换。

②移码突变（frameshift mutation）：DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基所引起的突变。由于增加或减少一个或几个碱基，则整个遗传密码的顺序发生改变，从而引起突变。移码突变中碱基的插入或缺失不包括三个或三个的整倍数。当发生插入或缺失的碱基数目为三或三的整倍数时，则该点后面的密码组可以恢复，后面的氨基酸顺序也可恢复正常。多环芳烃、黄曲霉毒素和吖啶类化合物（原黄素、吖啶橙等）均具有导致移码突变的性质。

（2）染色体畸变。

染色体畸变的化学基础和机理与基因突变相同，只是染色体在受到化学致突变物的作用后，发生了更为严重的损伤和破坏，出现了可以用显微镜直接观察的变化。染色体畸变包括染色体数目和结构的变化。

①染色体数目变化。各种生物的染色体都有一定的数目，正常的生殖细胞染色体为单倍体，体细胞为二倍体。在正常情况下，人类染色体是二倍体即2n＝46，或23对，在突变细胞中，染色体数目的变化可能是整倍地变化，从而形成三倍体即3n＝69，或四倍体即4n＝92。三倍体以上称为多倍体。人类自然流产胎儿中，有三倍体出现；人体细胞体外培养，偶尔可见四倍体。

根据目前的资料，化学致突变物质多数引起非整倍体畸变，如二氧化硫、环磷酰胺、镉、氨甲喋呤等可在哺乳类动物卵细胞引起非整倍体的出现，二溴氯丙烷、阿霉素等可使接触人群出现Y染色体分离现象，秋水仙碱、丝裂霉素可使在体外培养的人类淋巴细胞出现有丝分裂不分离。

②染色体结构变化。染色体结构发生变化的机理是在致突变物作用下，DNA分子结构受到严重破坏，并由此出现不同类型的结构畸变。染色体结构畸变主要有缺失、重复、易位、倒位四种类型，其中：缺失（deletion）是指染色体断裂后，由于断片的丢失，其携带的遗传信息引起的结构变化；重复（duplication）是指一条染色体增加了一段重复的基因组所引起的结构变化，即染色体断裂后形成的片断，接上另一同源染色体；易位（translocation）是指两条非同源染色体同时断裂引起的结构变化；倒位（invertion）是指染色体断裂后，其断片发生180°倒转后，重新接到原来染色体断端上，以致所含有的遗传信息在一条染色体内重新排列。易位和倒位只引起基因排列顺序的改变，基因数目并未改变。

（3）DNA损伤修复。

越来越多的事实证明，诱发突变主要是一个受控制的过程，突变频率与酶性DNA修复及其防错系统的效应成负相关。

DNA损伤的修复可细分为四种：复制前改正错误、复制时避免错误、复制后避免错误和复制后DNA修复。如果其中任一种使得DNA损伤能够正确修复，突变就不会出现；如果修复错误或没有修复，突变就“固定”下来。另外，有时诱变物本身也直接导致错误修复。例如，当诱变物直接影响聚合酶的活性或抑制某种单核苷酸前体的合成时，就易于发生错误修复。

3）致突变作用的后果

突变是生物界的一种自然现象，通过突变形成新种，使生物界进化。自发突变在自然界中的发生频率在时间上已证实对人类的发生、存在与发展是有利的。而现代科学发展所使用的众多化学物质，已发现有上千种具有诱变能力，且这个数目还在不断增大，这势必会提高可遗传突变的频率。对大多数个体来说，突变往往是有害的，故不论突变的后果如何，应将致突变作用看成是环境污染物毒性作用的一种表现，并以此来分析其环境毒理学效应。化学致突变作用可发生在体细胞或生殖细胞，导致的后果并不相同。体细胞的突变仅涉及该细胞，影响该个体。体细胞突变与癌症、动脉硬化、衰老等有关。体细胞正常增殖发生异常，形成异常的细胞群，这些细胞群是发生恶变的基础，当一定条件下发生急剧增殖，就可逐渐形成癌肿。体细胞突变的后果中最令人关注的就是致癌问题。生殖细胞突变影响到后代，如不是致死性突变，可导致后代的生化组成的遗传学差异，造成遗传易感性疾病或遗传性疾病。生殖细胞突变可使正常妊娠发生障碍，视影响程度不同，可出现不孕、早期流产、胎儿死亡或造成先天性畸形。

4）化学致突变物的检测与评价

通常采用致突变试验来检测化学致突变性。致突变试验能检测环境污染物导致的细胞遗传物质损伤及可遗传性改变的程度，预测环境污染物对生物体细胞的致突变性和致癌性。致突变试验既能够直接检测原发性的遗传学指标，也能够检测某一指标的DNA损伤即产生突变过程所伴随的现象。通常将观察到的指标、现象称为毒性端点。依据观测的这些毒性端点，可确定环境污染物对生物体是否具有致突变作用，证实受试化学物质是否具有干扰机体遗传过程完整性的能力。

目前，肿瘤形成主要被认为是体细胞突变的结果，因此致突变试验检测的目的除直接确定外来化学物质是否具有致突变作用外，还可对环境污染物是否具有致病作用进行初步筛选。

致突变试验的检测方法很多，采用的生物系统也很多，如真菌、细菌、细胞株和哺乳动物等。致突变试验根据所检出的突变类型，可分为基因突变试验和染色体畸变试验，根据采用的试验材料可分为微生物试验（包括细菌、真菌、酵母菌）、昆虫试验（果蝇）、哺乳动物细胞株试验和哺乳动物试验，根据试验时间的长短可分为短期致突变试验和长期致突变试验，根据发生突变的细胞可分为体细胞突变试验和生殖细胞突变试验，根据试验的方式可分为体内试验和体外试验。

（1）细菌回复突变试验。

细菌回复突变试验（bacteria reversion or backward mutation test），即鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验，亦称微粒体间介法（microsome mediated assay），是一种利用微生物进行的体外基因突变试验，通常叫Ames试验。

其基本原理是利用一种突变型微生物，使其与受试化学物质接触，如果这种化学物质具有致突变性，则可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。第一次突变称为正向突变，即野生型微生物突变成为突变型微生物的突变过程。第二次突变称为回复突变，即突变型微生物再次成为野生型微生物的过程称为回复突变。

在大自然中，一种生物大多数个体所表现的类型称为野生型，也称为正常型。突变型微生物与野生型微生物在外观形态和生理功能上有一定差异，如菌落颜色可能不同、缺乏合成某种必需营养元素的能力等。将缺乏合成某种营养元素能力的突变型微生物称为营养缺陷型微生物。

Ames法是利用组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌突变株为测试指标菌，观察其在受试化学物质的作用下，回复突变为野生型的一种测试方法。野生型能合成组氨酸，可在低营养的培养基（即不含或仅含微量组氨酸）上生长成为菌落，便于计数。如果菌落数明显多于对照即为阳性。由于本法可将哺乳动物的肝细胞微粒体及受氢体系统一并加入营养基，使受试化学物质在体外受到与体内类似的代谢活化作用，故更符合机体内实际情况，也比较灵敏。

Ames法检测结果与动物致癌作用相符率较高（可达90%），其假阳性和假阴性率较低（约10%）。一般48h可出结果，费用亦较低，是检验致突变性较为简便的方法。

（2）哺乳动物细胞株突变试验。

20世纪70年代对哺乳动物体细胞诱变的实验研究，在微生物基因点突变方法的基础上，逐步建立了哺乳动物细胞株的突变试验。常用的细胞有中国仓鼠肺V79细胞系（简称V79细胞系），中国仓鼠卵巢细胞系（CHO细胞系），以及小鼠淋巴瘤细胞株化而成的L5178Y细胞系。

V79细胞系和CHO细胞系都缺少利用次黄嘌呤、鸟嘌呤转磷酸核糖基酶（简称HGPRT），这种酶是细胞中嘌呤核苷酸生物合成的一条补充途径中的酶。当把某些嘌呤碱基类似物如6-巯基嘌呤（MP），6-硫代鸟嘌呤（TG）及8-氮杂鸟嘌呤（AG）加入到培养基中，则以这些碱基类似物为底物时，将合成能使细胞死亡的异常嘌呤核苷酸，产生毒性作用。这是由于TG和AG仅仅是在化学结构上类似嘌呤碱，并不真正具有嘌呤碱的生理功能，因此在细胞DNA合成过程中虽然利用了它们，但细胞却得不到所需的真正的嘌呤碱，以致不能生长。而突变型细胞由于缺乏利用嘌呤碱的酶，不受这些碱基类似物的影响，对MP、TG、AG产生抗性，在培养基上生长良好。

当突变型细胞接触了致突变物时，可再一次发生突变，即回复突变成为正常细胞，此时恢复了利用嘌呤碱的酶。因此和正常细胞一样利用具有毒性的嘌呤碱类似物，以致中毒不能生长。借助上述观察确定突变细胞株是否发生了回复突变，从而鉴定受试化学物质是否具有致突变性。

（3）染色体畸变分析。

染色体畸变分析是直接观察在致突变物作用下，生物体的细胞染色体发生的结构或数目改变，亦称细胞遗传分析（cytogenetic analysis）。染色体畸变分析可在体细胞中进行，亦可在生殖细胞中进行，可在体内进行，亦可在体外进行。一般常用动物骨髓细胞和外周血细胞代表体细胞，以睾丸精原细胞代表生殖细胞。

体外染色体畸变试验多以CHO细胞作为检测细胞。CHO细胞分裂速度快，数目适中，形态清晰，国际通用。短期体外培养人类外周血细胞，检测人类淋巴细胞也是一种简便可行的方法。体内染色体畸变试验，即在染毒后观察骨髓细胞及其他组织内染色体畸变率。通常对细菌有致突作用的化学物质，大多数亦能在大鼠、小鼠、地鼠及人骨髓细胞中诱发染色体畸变。

试验动物常用出生后8～15周左右的大鼠或小鼠。给予受试化学物质的次数在急性试验为1次，亚急性为5～7次，慢性试验可达3个月。多次给予者，每日1次。剂量分组可以最大无作用剂量为高剂量组，以人体实际接触量为低剂量组，可设中间剂量组。除对照组外，还可以一已知致突变物为阳性对照组。每组动物5只即可，处死动物取出骨髓或睾丸前2～5h应注射秋水仙碱，使细胞有丝分裂停留在中期，以便观察。取出骨髓或精原细胞后用低渗KCl溶液进行低渗处理，然后固定制片、染色，最后观察染色体畸变状况。

（4）微核试验。

微核（micronucleus）是染色体断裂碎片在分裂间期留在子代细胞内形成的小块物质，也可能是由于细胞分裂时纺锤丝受损所致。在致突变物作用下，细胞染色体发生突变后，可出现断裂，并可有部分断片在有丝分裂后期不移向两极，在有丝分裂末期不进入分裂的细胞核，因而存留在间期细胞内，形成一个或几个圆形、杏仁状结构，并存留一定的时间。由于此种圆形、杏仁状结构比普通细胞核小，故称微核。典型的微核呈圆形，直径相当于红细胞直径的1/20～1/5。由于染色体断裂既是产生微核的主要原因，又是染色体结构异常的根本条件，因此微核试验与染色体畸变分析的灵敏度基本一致，对相同受试化学物质定性反应相同，出现阳性反应的最低浓度也基本一致。且由于微核试验技术简单、时间短，因此近年来广泛用于检查外来化学物质的致突变作用。它也是一种细胞遗传学试验。

在骨髓细胞检查微核时，常检查多染红细胞中的微核。骨髓细胞微核检查可与染色体畸变分析同时进行。骨髓取出后可在胎牛或小牛血清中制成混悬液，再离心、涂片，并按骨髓细胞染色体分析法染色，同时应用荧光染色技术，提高该方法的灵敏度和准确性。

（5）显性致死突变试验。

显性致死突变试验（dominant lethal mutation test）是通过哺乳动物生殖细胞染色体畸变进行的致突变作用试验。哺乳动物生殖细胞染色体发生突变时，往往不能与异性生殖细胞结合，或者结合后会出现发育不正常的胚胎，以致造成总着床数减少或早期、晚期胚胎死亡及畸胎等现象。显性致死突变试验是通过动物生殖细胞突变进行的化学致突变作用试验。出现显性致死突变的机理，可能是生殖细胞染色体交联、断裂和易位。

显性致死试验通常是将受试化学物质给予年幼、初断奶的雄性大白鼠或小白鼠，直至其成熟后，同时并分批与未经处理的成熟雌鼠交配。然后分阶段剖腹雌鼠（从交配的第3～4天算起，至第12天、第13天，大白鼠按此时间后延12天）检查，记录黄体数、着床数、早期胚胎死亡数、晚期胚胎死亡数和生存胎仔数，并与对照组对比。该试验是在动物体内进行，能够可靠地反映致突变作用，而且不需要特殊设备条件，结果容易观察，是一种较为实用的办法，但所用的动物数量大，而且只能表明毒物对雄性动物生殖细胞的致突变作用。

（6）姊妹染色单体交换试验。

每条染色体是由两个染色单体组成的，一条染色体的两个染色单体之间的DNA相互交换，即称姊妹染色单体交换试验（sister chromatid exchange test，简称SCE试验），属于DNA损伤试验。此种交换多发生在染色体断裂或缺损部位，所以当染色体受到损伤时SCE出现的频率增加。姊妹染色单体交换的本质不属突变，只是对等染色单体中某一段进行互换，但许多化学致突变物可以引起姊妹染色单体交换率增加，其出现频率与染色体畸变频率之间呈相关关系，而且有些致突变物在不能引起其他类型突变浓度下，仍可使姊妹染色单体交换数目大大增加，所以，姊妹染色单体出现交换的频率，即平均每个细胞姊妹染色单体交换的数目，可作为化学致突变作用的灵敏度观察指标。

5．化学致癌作用

1）基本概念

肿瘤（tumor）是当前危害人类的主要疾病之一。初步估计，人类肿瘤有80%～90%与环境因素有关，而在人类肿瘤病因分析中，与化学因素有关者可占80%～85%。因此在环境毒理学中，化学致癌作用的研究占有极其重要的地位。

环境毒理学中的致癌作用既包括恶性肿瘤，也包括良性肿瘤。目前为止，还没有发现只引起恶性肿瘤而不引起良性肿瘤的致癌物，而且良性也可癌变。通常动物致癌试验结果评定的标准如下。①动物试验中，对照组动物不出现肿瘤，而试验组出现肿瘤，或对照组出现的肿瘤在试验组出现的频率较高，二者的差异具有显著性。②试验组的动物中，同一个体出现的肿瘤类型增多，即多发性肿瘤，而对照组中无多发性或只有少数动物有多发性肿瘤。与对照组相比，试验组每一动物的肿瘤数增加。③试验组与对照组动物肿瘤的发生率无显著差异，但试验组肿瘤发生的时间提早，即潜伏期长。

凡是具有上述情况，即认为受试化学物质具有致癌作用，引起上述情况的化学物质即为化学致癌物。物理因素（如慢性机械性刺激、紫外线、放射性射线等）和生物因素（如病毒寄生虫等）也可引起癌症，但环境毒理学中研究得较为广泛和深入的仍是化学致癌作用。

2）癌的形成过程

癌的形成过程包括引发阶段、促长阶段、浸润和转移阶段。引发（initiation）是指少数正常细胞转变为癌细胞的过程。各种化学致癌物的化学结构各不相同，但有一共同的特点，即皆为亲电子化合物。所谓亲电子化合物是指其分子结构中含有电子贫乏的原子的一类化合物。细胞中的大分子化合物都具有亲核基团，即具有富含电子的部位，因此，致癌物极易与细胞大分子结合。DNA、RNA和蛋白质等大分子化合物的亲核基团就是致癌物结合的位置。

致癌物与DNA结合发生反应使细胞内染色体或基因发生突变，同时亦可与蛋白质发生反应，使细胞中的基因调控过程发生改变，并出现代谢障碍。在此种突变或基因调控障碍基础上即可形成癌变。引发过程中所发生的各种变化还必须能避免机体内的正常DNA修复过程和体细胞免疫监视机能，如此才能使化学致癌物所引起的变化成为永久性变化，使正常细胞转化成癌细胞。引发过程只需要极短时间，数小时甚至数分钟即可完成，而且一般为不可逆过程。

促长（promotion）是指经过引发的致癌细胞不断增殖，直到形成一个临床上可被检出的肿块的过程。这一过程需要较长时间才能完成。一般认为癌细胞经30代增殖，即2³⁰（约10⁹）个细胞时，才能成为一个1cm³大小的肿瘤，临床上方能检出。完成这一过程的时间，约为动物生命期的1/8～1/4，人类约需15～20年。不过，癌细胞经20次分裂，总数达10⁶个细胞，体积为1mm³时，就能抵抗机体的免疫力，增殖速度大幅度加快。促长阶段存在消长现象，有时已增殖到一定程度的癌细胞数目有减少的可能，肿瘤缩小，促长阶段为可逆过程。

促长阶段可观察到癌细胞的鸟氨酸脱羧酶与纤维蛋白酶活性增强，组蛋白、磷脂合成增加，细胞膜成分蛋白质酶、糖脂异常，出现细胞接触性抑制消失，使已经形成的癌肿不断发展，并逐渐侵害周围的正常组织和扩散到体内较远的部位，这一过程称为浸润和转移阶段。

3）化学致癌作用的生物学特点

化学致癌作用作为一种毒性效应，主要有以下生物学特点。

（1）与大多数外来化学物质经体内代谢转化毒性降低不同，绝大多数化学致癌物是经过体内代谢转化后方呈现致癌作用的。代谢活化致癌，是化学致癌作用极其重要的特点。

（2）化学致癌作用除有种属、品系、性别、年龄差异外，还表现出明显的组织易感性和脏器特异性。一般来说，活跃增生的组织细胞具有较高的易感性，易发生癌变。脏器特异性是指一种致癌物往往引起特定的脏器肿瘤。如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍特异地诱发胃癌，而3′-甲基-4-二甲基-氨基偶氮苯诱发肝癌。脏器特异性除取决于某特定脏器能选择性地集中高浓度的致癌物外，还与该脏器对致癌物的代谢酶以及其他代谢转化条件有关。

（3）一般毒物的毒性作用表现较快，作用时间较短，一旦脱离接触，多可很快恢复。但化学致癌物的生物学效应却表现较为持久，即使停止接触，仍可能出现癌肿。此外，化学致癌作用多表现为“迟发”，即从接触致癌物到发生肿瘤的潜伏期较长，人类大约为5～30年，其他动物大多与其寿命成一定比例。有的致癌物通过胎盘影响子代，要在子代成年后方出现肿瘤，如孕期摄入己烯雌酚的孕妇，可在其子代子宫诱发细胞恶变，但只在子代出生后15～19岁才发展成癌。

（4）在某些情况下，虽然致癌作用的强弱可以观察到与接触致癌物的剂量成正比，剂量越大，肿瘤发生率越高，潜伏期也越短。但一般来说，致癌作用的潜伏期相对较长，发病率亦较低，而且不同致癌物诱发癌肿的剂量可有1～1000万倍的差异。因此，要明确区分致癌物与非致癌物有时相当困难，特别是阈剂量的确定，是当今毒理学相关研究中正在讨论的问题之一。从目前的资料来看，对人致癌的化学污染物，虽多有环境或工业卫生标准，但对于人来说，却难于确定其阈剂量或安全无害的最大无作用剂量。

（5）同样剂量的化学致癌物若多次小剂量与机体接触，其致癌作用比一次大剂量接触更强。

（6）肿瘤的发生是一个多阶段的过程，包括引发阶段和促长阶段。不同阶段需要不同的因素促成，癌肿的形成是多因子多重效应的总和。环境中各因素的相互作用，以及肿瘤形成的本身特点，使得化学致癌作用远较一般毒性作用复杂。

（7）化学致癌作用的作用机理与一般毒物的不同。后者通常是引起细胞死亡并由此出现生物学效应，其作用部位多为生物膜。化学致癌物则是与细胞核的遗传物质及大分子结合，其结果并不是引起细胞死亡，而是使细胞的遗传物质发生突变或影响基因调控，使细胞恶变，失去正常控制，生成癌肿。

4）致癌危险评价方法

环境化学污染物质的致癌危险评价是一项非常重要而且相当复杂的科研工作，利用整体动物的长期致癌试验和肿瘤流行病学调查，目前仍为该项研究的重要方法。为了满足大量存在于环境中的化学物质进行致癌试验的实际要求，以致癌机理中最重要的体细胞突变学说为理论基础，提出了把简单快速的致突变试验作为检测化学致癌物的筛选手段。致癌试验是检验受试化学物质及其代谢产物是否具有致癌作用或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验方法。

（1）哺乳动物长期致癌试验与评价。

哺乳动物长期致癌试验与评价是鉴定动物致癌的最为可靠、应用最多的一种统计方法，是采用受试哺乳动物终生或长期接触受试化学物质的试验。由于化学致癌物的最大特点之一是潜伏期长、发病率低，而动物致癌试验只需要相对较短时间即可进行终生染毒并获得评价资料，因此动物致癌试验是十分必要的。对那些经短期试验证明有潜在致癌性的化学物质，或化学结构与已知某些致癌物非常接近的化学物质，应优先安排哺乳动物的长期致癌试验。

一般选择小型哺乳动物，多用大白鼠或小白鼠，而不常用大动物（因其寿命长，增加试验困难）。受试动物要选择肿瘤自发率低，抗病力强，容易饲养，对受试化学物质敏感的品种。可选择断乳后6～8周的大鼠或小鼠，而且饮用水和饲料中的污染物不应超过国家容许浓度标准，并保证动物的营养水平。所用剂量，既要避免因剂量过高引起其他毒性作用，防止动物在肿瘤的潜伏期中死亡，也要尽量排除过低剂量对动物无影响而做出的“无致癌性”的结论。

一般认为高剂量组可略高于毒阈剂量或略高于最大无作用剂量，以高剂量组的1/4～1/3为低剂量组。通常设对照组、最大无作用剂量组和两个中间剂量组，共4个组，如果能估计到人的实际摄入量，则应将其10～100倍剂量考虑在内。剂量设置可参照亚慢性毒性试验和急性毒性试验结果。若无这方面资料，可先进行预试验。受试化学物质投给动物的途径一般是经口摄入，可结合受试化学物质与人接触的方式与条件，例如可经呼吸道和皮肤染毒。哺乳动物的长期致癌试验时间一般为一年或两年时间，对那些可通过胎盘和乳汁传递的物质还需观察其后代。

观测指标按慢性毒性试验中规定的指标，一般头3个月每周一次动物称重，以后每两月一次。每天观察两次，详细记录死亡和临床异常的动物。试验为24个月。15个月时每组雌雄各处死10只，24个月时处死其余动物，进行详细病理及血液生化分析，主要观察肿瘤出现的情况，即肿瘤的出现时间、部位、大小、数目、外形、硬度及发展状况。对自然死亡和试验结束时处死的动物都应做完整的尸体解剖，观察检测所有组织器官，同时对肿瘤组织、可疑肿瘤组织及肉眼不能判断的其他病变均需做病理组织学处理。肿瘤发生率应包括良性、恶性及二者的总发生率，同时分别统计各个不同器官的肿瘤发生率，其计算公式为

（2）短期筛选方法。

利用整体哺乳动物的长期致癌试验方法，虽结果准确可靠，但时间过长、费用较高，不能满足每年成千上万的新的化学物质出现而需要进行致癌试验的要求。根据肿瘤出现的“体细胞突变学说”，已建立和发展了一些以致突变试验为基础的方法对化学致癌物的致癌性进行初步筛选，同时还利用哺乳动物细胞株，进行体外恶性转化试验，确定受试化学物质的致癌作用。短期筛选受试化学物质是否有致癌性的重要方法是哺乳动物细胞体外转化法，是将受试化学物质在体外与哺乳动物细胞株接触，若受试化学物质具致癌作用，则正常细胞的形态、功能发生变化而与癌细胞相似，此种现象称为转化或恶性转化。恶性转化的细胞失去接触抑制，在培养基上生长形成“克隆”，糖酵解方式改变，形成新的特异抗原等。通过增殖，这些表型变异细胞形成与正常细胞不同的集落，即转化集落，利用这些集落的存在、形成率以及转化细胞接种于裸鼠中发生肿瘤的情况来评价化学物质的致癌活性。有的细胞可将前致癌物代谢为终致癌物，方法操作快速，理论上可靠。实验证明，细胞恶性转化法与Ames法配套使用，几乎可以检出98%～99%的致癌物。由于哺乳动物细胞体外转化快、试验周期短、简便经济、易于观察、灵敏度高，且受试化学物质直接作用于靶细胞，便于剂量控制，免受裸体动物体内免疫系统和生物转化、生物转运的影响，因此这种短期筛选致癌试验的方法目前应用比较广泛和深入。

致癌危险评价，除了采用致癌物短期快速筛选和进行动物致癌试验外，还可采用流行病学调查法。经验证明，大多数化学物质的致癌性是依据职业性接触人群的流行病学调查而确定的。肿瘤流行病学调查应包括前瞻性和回顾性调查，重点调查各种肿瘤发生率、死亡率、潜伏期、剂量-反应关系以及接触剂量与肿瘤发病率和死亡率的关系。同时，应有动物致癌试验或细胞恶性转化试验的支持，只有这样，才能得到具有说服力的结果。

6．化学致畸作用

1）基本概念

有些化学物质可使胚胎或胎儿的生长发育过程受到干扰，影响其正常发育，以致胎儿在出生时具有某种器官形态结构异常，此种作用称为致畸作用。器官形态结构的异常称为畸形（malformation），具有畸形的胚胎或胎儿称为畸胎（teratism）。凡能通过母体干扰胚胎或胎儿正常发育使其出生时具有畸形的外来化学物质称为致畸物（致畸原，teratogen）。因此畸形是胚胎或胎儿的某些细胞在生长发育的最敏感阶段受损或死亡的结果。

外来化学物质可通过多种途径对生长发育中的胚胎或胎儿造成损害，导致致畸作用和胚胎毒性作用。有许多外来化学物质在一定剂量范围内对母体并不引起损害作用，但对胚胎具有毒性作用，可以在胚胎发育的初期使胚胎死亡；亦可在胚胎发育过程的后期使胎儿死亡，其具体表现为死胎率增加。此种对胚胎或胎儿的致死作用，称为胚胎毒性作用（embryotoxicity）。致畸作用与胚胎毒性作用不同。致畸作用系某些外来化学物质对胚胎造成损害，以至于在存活胚胎表现出发育障碍，使活产胎儿出生时，某些器官出现形态缺陷或异常。而胚胎毒性作用主要表现为死胎率增高。但胚胎死亡有时与畸形同时发生，可能仅为程度的不同，并不存在本质区别。

2）致畸作用的影响因素

致畸作用主要受致畸物的种类、数量、作用时期、作用时间长短以及动物类型品系等方面的影响。有性生殖动物由受精卵发育成为与亲代相似的成熟个体的过程中，要经过着床、分化和器官形成等阶段。胚胎与致畸物发生接触时，可因胚胎所处的发育阶段不同，而呈现不同的敏感性。一般在器官形成期胚胎最为敏感，这一时期称为敏感期或危险期。一种致畸物在敏感期与胚胎接触时，可因胚胎处于不同发育阶段（受孕后天数）而引起不同的畸形。例如以20mg/kg体重剂量的环磷酰胺分别在受孕后第8、9、10、11和12日给予小鼠，虽然都出现前肢趾部畸形，但所出现的主要畸形则有不同，分别为多趾、并趾、缺趾和无趾。

剂量-效应关系在致畸作用中也较为明显，且呈对数剂量关系，即剂量以对数表示时，与反应关系最为明显。例如放线菌素D按0．2mg/kg体重剂量在受孕后第8天给予大鼠，出现的死胎、吸收胎占胚胎总数的4．2%，如将剂量增加到0．3mg/kg体重，则可高达84．8%。

任何毒性作用中都存在种属差异以及个体差异，在致畸作用中更为突出。同一致畸物在不同种属动物是否具有致畸作用或引起何种类型畸形，可以完全不同。例如西维因对豚鼠具有致畸作用，但在家兔和地鼠中并不存在。某些烷化剂对某些动物具有明显致畸作用，对人则没有这种作用。敌枯双对大鼠明显致畸，而在人群调查资料中尚未能证实。

致畸作用中还表现出品系差异，同一种动物的不同品系可对同一致畸物呈现不同敏感性。这可能由于不同种属不同品系动物对致畸物的代谢过程不同、胎盘构造亦有差异所致，其本质可能是遗传因素，即基因型的差异。

3）致畸危险评价

致畸试验（teratogenisis test）是检测某些环境污染物是否能通过妊娠母体引起胚胎畸形的动物试验。通过致畸试验评价某种受试化学物质的致畸危险，即是否具有致畸作用，主要诱发何种畸形、出现畸形的主要器官以及确定最大无作用剂量和最小有作用剂量即阈剂量，探讨致畸作用机理。

（1）致畸试验设计。

致畸试验的动物应选择和受试化学物质在人体的代谢过程相似，妊娠孕期应较短（以利观察）、每次产仔量应较多（以便获得足够的样本）的种类，而且应尽量符合体型小、易驯服、易繁殖、价廉等一般试验动物的需求。致畸试验一般多采用大鼠、小鼠和家兔，其中大鼠最为常用。致畸试验的剂量分组可根据研究目的确定：若试验要求确定受试物有无致畸作用的定性评价，那么剂量组数应较少，每组动物数目相对较多，剂量也需较高；若拟确定受试化学物质的剂量-效应关系，且确定体内靶器官，就应增多剂量分组组数。由于致畸试验剂量确定较为复杂，最好经过预试验，通常至少应设三个剂量组，即高剂量组、中间剂量组和低剂量组，同时设立对照组。剂量组动物数，以受孕的雌性动物为计数，每组动物数为大鼠或小鼠15～20只、家兔8只、大动物3～4只，试验中还应设阴性对照组和阳性对照组。

（2）致畸效果统计。

①畸胎出现率，即出现畸胎总数在活胎总数中所占的百分数（%）。

畸胎出现率（%）＝（畸胎总数/活胎总数）×100%　　　（10．12）

②每个活产胎仔平均畸形出现数，即根据出现各种畸形的总数，计算在每个活产胎仔出现的平均数。

活产胎仔平均畸形出现数＝畸形总数/活胎总数　　　（10．13）

③母体畸胎出现率，即根据出现畸胎的形体数来计算出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。计算出现畸形母体数时，同一母体不论出现多少畸形胎仔或多少种畸形，一律按一个出现畸形胎仔的母体计算。

母体畸胎出现率（%）＝（出现畸形母体数/妊娠母体总数）×100%　　　（10．14）

根据上述指标的计算结果进行致畸危险的最后评价，确定受试化学物质是否具有致畸作用时，必须注意以下问题。第一，充分考虑致畸作用的剂量-效应关系，通过统计分析肯定试验组出现致畸的母体显著高于对照组，并且试验组动物活产胎仔出现的畸形率应显著高于对照组，才可能具有致畸作用。第二，致畸作用的确定必须考虑同种动物的重复试验和多种动物试验结果的一致性。同时，任何化学物质对动物的致畸作用，不能简单地推论对人类一定具有致畸性。一方面应进一步开展相关的人群流行病学调查，另一方面应尽量减少与人类的接触。第三，生物体的自然变异与畸变之间的区分问题有时难度很大，试验中要注意，若变异（畸形）出现率高，又有特异性，并具有剂量-效应关系，应按致畸看待。第四，许多环境污染物达到一定剂量，都可呈现致畸作用，人体必需营养素如维生素A，一定剂量下也具有致畸作用。任何化合物以一定的剂量在一定的胚胎发育阶段与一定种属动物接触都可干扰胚胎的发育，并可能具有致畸作用。此外，还应充分考虑受试化学物质可能与人体接触的方式和途径。致畸危险评价应特别注意与人类实际接触的剂量问题，进而做出最后的判定。