日新月异的细菌观察诊断技术

为了能更清楚地观察细菌，人们除了采用显微镜，还对其进行了染色处理，这就是染色法。

染色法是染色剂与细菌细胞质的结合。最常用的染色剂是盐类。其中，碱性染色剂（basic stain）由有色的阳离子和无色的阴离子组成，酸性染色剂（acidic stain）则相反。菌细胞富含核酸，可以与带正电荷的碱性染色剂结合；酸性染色剂不能使细菌着色，而使背景着色形成反差，故称为负染（negative staining）。

染色法有多种，最常用最重要的分类鉴别染色法是革兰染色法（Gram stain）。该法是丹麦细菌学家革兰（Hans Christian Gram）于1884年创建，至今仍在广泛应用。

丹麦细菌学家革兰

该方法是将标本固定后，先用碱性染料结晶紫初染，再加碘液媒染，使之生成结晶紫—碘复合物；此时不同细菌均被染成深紫色。然后用95%乙醇处理，有些细菌被脱色，有些不能。最后用稀释复红或沙黄复染。

此法可将细菌分为2大类：①不被乙醇脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌，②被乙醇脱色后复染成红色者为革兰阴性菌。

革兰染色法在鉴别细菌、选择抗菌药物、研究细菌致病性等方面都具有极其重要的意义。

虽然至今革兰染色法的原理尚未完全阐明。但与菌细胞壁结构密切相关，如果在结晶紫—碘染之后，乙醇脱色之前去除革兰阳性菌的细胞壁，革兰阳性菌细胞就能够被脱色。目前，对革兰阳性和革兰阴性菌细胞壁的化学组分已十分清楚，但对革兰阳性菌细胞壁阻止染料被溶出的原因尚不清楚。

细菌染色法中尚有单染色法、抗酸染色法，以及荚膜、芽胞、鞭毛、细胞壁、核质等特殊染色法。

但对于致病性细菌，人们则采用了更复杂的一套检验和诊断方法，其主要包括：分离培养、生化试验、血清学试验、动物试验、药物敏感试验、分子生物学技术等。

从原则上来讲，所有标本均应作分离培养，以获得纯培养后进一步鉴定。原为无菌部位采取的血液、脑脊液等标本，可直接接种至营养丰富的液体或固体培养基。从正常菌群存在部位采取的标本，应接种至选择或鉴别培养基。接种后放37℃孵育，一般经16～20小时大多可生长茂盛或形成菌落。少数如布鲁菌、结核分歧杆菌生长缓慢，分别需经3～4周和4～8周才长成可见菌落。分离培养的阳性率要比直接镜检高，但需时较久。

布鲁菌

细菌的代谢活动依靠系列酶的催化作用，不同致病菌具有不同的酶系，所以其代谢产物不尽相同，因此根据这个可对一些致病菌进行鉴别。例如肠道杆菌种类很多，形态、染色性基本相同，菌落亦类似。但它们的糖类和蛋白质的分解产物不完全一样，因而可利用不同基质进行生化试验予以区别之。

采用含有已知特异抗体的免疫血清与分离培养出的未知纯种细菌进行血清学试验，可以确定致病菌的种或型。常用方法是玻片凝集试验，在数分钟内就能得出结果。免疫荧光、协同凝集、对流免疫电泳、酶免疫、间接血凝、乳胶凝集等试验可快速、灵敏地检测标本中的微量致病菌特异抗原。这些方法的另一优点是即使患者已用抗生素等药物治疗，标本中的病菌被抑制或杀死培养不成功时，其特异抗原仍可检出，有助于确定病因。

动物试验主要用于分离、鉴定致病菌，测定菌株产毒性等。常用实验动物有小鼠、豚鼠、家兔等。应按实验要求，选用一定的体重和年龄，具有高度易感性的健康动物。接种途径有皮内、皮下、腹腔、肌肉、静脉、脑内、灌胃等。接种后应仔细观察动物的食量、精神状态和局部变化，有时尚要测定体重、体温、血液等指标。若死亡应立即解剖，检查病变，或进一步作分离培养，证实由何病菌所致。含杂菌多的标本，也可通过接种易感动物获得纯培养，达到分离致病菌的目的。例如将疑患肺炎链球菌性肺炎病人痰接种至小鼠腹腔。测试细菌的产毒性，可用家兔或豚鼠皮肤检测白喉棒状杆菌是否产生白喉毒素；家兔结扎肠段测定大肠埃希菌不耐热肠毒素等。

人们将疑患肺炎链球菌性肺炎病人痰接种至小鼠腹腔以分离致病菌

药敏试验对指导临床选择用药，及时控制感染有重要意义。其方法有纸碟法、小杯法、凹孔法、试管法等，以单片纸碟法和试管稀释法常用。纸碟法是根据抑菌圈有无、大小来判定试验菌对该抗菌药物耐药或敏感。试管法是以抗菌药物的最高稀释度仍能抑制细菌生长管为终点，该管含药浓度即为试验菌株的敏感度。

随着分子生物学技术的发展，人类应用核酸杂交和PCR技术检测致病细菌核酸也取得了很大的进展。

核酸杂交技术的原理是应用放射性核素或生物素、地高辛苷原、辣根过氧化物酶等非放射性物质标记的已知序列核酸单链作为探针，在一定条件下，按照碱基互补原则与待测标本的核酸单链退火形成双链杂交体。然后，通过杂交信号的检测，鉴定血清、尿、粪或活检组织等中有无相应的病原体基因及其分子大小。

核酸杂交技术有液相与固相之分。固相核酸杂交较常用，有原位杂交、斑点杂交、Southern印迹、Northern印迹等。核酸杂交可从标本中直接检出病原体，不受标本中的杂质干扰，对尚不能或难分离培养的病原体尤为适用。用核酸杂交技术来检测细菌感染中的致病菌，有结核分歧杆菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希菌等。

PCR技术是一种无细胞的分子克隆技术，能在体外经数小时的处理即可扩增成上百万个同一基因分子。PCR技术的基本步骤为从标本中提取DNA作为扩增模板；选用一对特异寡核苷酸作为引物，经不同温度的变性、退火、延伸等使之扩增；扩增产物作溴乙锭染色的凝胶电泳，紫外线灯下观察特定碱基对数的DNA片段；出现橙红色电泳条带者为阳性。若需进一步鉴定，可将凝胶中分离的PCR产物回收，再用特异探针确定。

PCR技术具有快速、灵敏和特异性强等特点，现已用于生物医学中的多个领域。在细菌学方面，可用PCR技术检测标本中的结核分歧杆菌、淋病奈瑟菌、肠产毒素型大肠埃希菌、军团菌等中的特异性DNA片段。

除此之外，人们也常采用其他一些方法来观察、检测细菌。比如有人用气相色谱法检测细菌在代谢过程中产生的挥发性脂肪酸谱，来诊断厌氧菌感染；对葡萄球菌、伤寒沙门菌、志贺菌等，人们用型特异噬菌体进行分型，以追踪传染源等。