第一节　免疫学诊断技术

一、皮内试验(Intraderminal test，ID)

寄生虫变应原刺激宿主后，机体产生亲细胞性IgE抗体和IgG4抗体，当将同样抗原注入皮内与抗体结合后，导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放出生物活性介质，引起注射抗原部位局部出现红肿。ID属Ⅰ型变态反应试验，少数受试者也可出现“迟缓相”反应(Ⅳ型变态反应)。

皮内试验操作简单，通常反应快速，敏感性较高，有一定的特异性，是寄生虫应用较早也较为广泛的一种免疫检测技术。但本试验多采用粗制抗原，交叉反应较多，假阳性率较高，而且所检测的抗体可在寄生虫杀灭后维持多年。因此，皮内试验一般只能作为寄生虫感染检测的辅助诊断，无疗效考核价值，主要是用于流行病学调查的粗筛。若用纯化抗原可在一定程度上提高特异性，减少假阳性。

一般是将适宜浓度的无菌皮试抗原0.03ml(肺吸虫抗原为0.1ml)，注射入消毒后的前臂屈面表皮内层形成皮丘。在邻近处或另一手臂同样注射生理盐水皮丘作为对照，15分钟后观察结果。如皮丘增大，或有红晕、水肿或伪足样扩展，最长径≥1cm，对照为阴性可判为阳性反应。注射2～4小时，甚至72小时后出现阳性反应仍有诊断意义。

皮内试验可应用于多种蠕虫病的诊断及某些螨类所致变态反应的诊断，如血吸虫病、肺吸虫病、肝吸虫病、棘球蚴病、囊虫病、旋毛虫病、肺螨病等的辅助诊断和流行病学调查。

二、沉淀试验(Precipitin test)

(一)免疫电泳(Immunoelectrophoresis，IEP)

免疫电泳是一项将免疫扩散与蛋白质凝胶电泳结合起来的免疫化学技术。先将抗原样品在凝胶板上电泳，不同组分蛋白质在电场作用下有不同的迁移率而被分开，然后在抗体槽中加入相应抗体进行双向扩散，当已分离的各组分抗原与抗体相遇，在两者比例适合时，即可形成肉眼可见的弧形沉淀线。在凝胶板负极端打孔、加入抗原;在正极端打孔、加入待测血清(孔径3mm，正负极孔距4～5mm)。在pH8.6的缓冲液中电泳时，带负电荷的抗原移向正极，而抗体则因电渗作用移向负极，形成对流。因此，抗原抗体在比例适合处便形成白色沉淀线，此即为对流免疫电泳(Counter－immunoelectrophoresis，CIEP)。由于在CIEP中蛋白质在电场中作定向移动而限制了自由扩散，因而提高了抗原与抗体的相对浓度，使其敏感性较免疫扩散和免疫电泳法提高10～20倍。近年来，CIEP的改进包括用酶或放射性同位素标记配体，如酶标记抗原对流免疫电泳(ELACIE)等。

免疫电泳省时、省料，可用已知的抗原检测抗体，反之亦可。目前，已被广泛应用于多种寄生虫病的免疫检验，如血吸虫病、旋毛虫病、肺吸虫病、棘球蚴病、黑热病、贾第虫病等。此外，还可用于寄生虫抗原分析、鉴定、观察抗体纯度及动态变化等。免疫电泳属中度敏感的检测技术。

(二)环卵沉淀试验(Circumoval precipitin test，COPT)

环卵沉淀试验为血吸虫病诊断的特有免疫检测方法。血吸虫卵内毛蚴分泌的抗原物质透出卵壳，与患者血清中特异抗体结合后，在虫卵周围形成光镜下可见的沉淀物，即为阳性反应。阳性反应虫卵的百分率称环沉率。

用熔化的石蜡在载玻片上画2条相互平行、距离20mm的直线，在直线之间滴加受试者血清2滴，用针尖挑取适量冻干血吸虫卵约100～150个加至血清中，混匀。覆盖24mm×24mm盖玻片，石蜡密封盖玻片四周。将标本置湿盒内，37℃下保温48小时，低倍镜下观察结果，必要时须观察72小时的反应结果。典型的阳性反应为泡状、指状、片状或细长卷曲状折光性沉淀物，与卵壳黏连，边缘整齐(图18－1)。在实验室亦可采用毛细塑管法代替玻片法，届时将管内混有血吸虫卵的血清滴在载玻片上(加盖玻片)，在低倍镜下观察即可。观察100个成熟虫卵，计算环沉率和反应强度比例。环沉率≥5%者为阳性;在基本消灭血吸虫病的地区，环沉率≥3%者即可判为阳性。环沉率在血吸虫病防治工作中具有重要参考价值。

图18－1　环卵沉淀反应

反应强度判断:

“－”:虫卵周围光滑无沉淀，或出现直径＜10μm的泡状沉淀物者为阴性。阴性反应必须观察全片。

“+”:虫卵周围泡状沉淀物＞10μm，累计面积＜虫卵面积的1/2，或指状沉淀物＜虫卵长径。

“++”:虫卵周围泡状沉淀物面积＞虫卵面积的1/2，或指状沉淀物≥虫卵长径。

“+++”:虫卵周围泡状沉淀物面积＞虫卵面积，或细长卷曲状沉淀物≥虫卵长径的2倍。

COPT是检查血吸虫病的重要免疫诊断方法之一，具有较高的特异性和敏感性，结果较可靠，现已成为临床治疗和疗效考核的依据。如果患者经治疗后3～5年环沉率仍大于等于3%，结合临床表现可考虑再次治疗。也被用于血吸虫病血清流行病学调查及疫情监测。近年来人们对COPT的方法作了一些改进，如双面胶纸条法，可省略石蜡封片，更简便易行，方法规范;血吸虫干卵抗原片(或膜片)是将分离的纯卵超声处理，定量滴加，烤干固定于玻片或聚乙烯薄膜上，此种干卵抗原片保存时间较长(在4℃下，半年)，有市售商品，操作简便。

(三)尾蚴膜反应(Cercarien－hullen reaktion，CHR)

血吸虫尾蚴与血吸虫病患者血清在体外共同孵育后，尾蚴抗原与特异性抗体结合，在尾蚴体表形成折光性套膜，即为尾蚴膜反应。这是诊断血吸虫病特有的一种免疫学检查方法。

将感染性钉螺十余只置于盛有清水的小烧杯中，水面下放一网筛防止钉螺爬出。将烧杯置灯光下，于20℃～25℃中保持4小时，逸出尾蚴用于试验，也可使用冻干尾蚴(室温下可保存4～5周)。取受试者新鲜血清2滴置于凹玻片中，用解剖针挑取尾蚴5～10条放入血清中，加盖玻片密封四周，湿盒内25℃～28℃中温育8～24小时，低倍镜下观察结果。孵育前可加入青霉素0.01ml(50 000U/ml)以防止细菌生长(图18－2)。

图18－2　尾蚴膜反应

结果判断:

“－”:尾蚴体表无反应，或口部、体表仅出现泡状、颗粒状或絮状附着物。

“+”:尾蚴体表全部或局部形成一层不明显的、平滑的折光性胶状膜。

“++”:尾蚴体表形成明显的稍有皱褶的胶膜或套膜，低倍镜下清晰可见。

“+++”:尾蚴体表形成一层厚的、明显皱褶的胶状膜或套膜，由于尾蚴的活动，有时可见空套膜。

CHR具有较高的特异性与敏感性，且有早期诊断价值，但与异种血吸虫病、肺吸虫病、华支睾吸虫病和尾蚴性皮炎患者的血清易出现交叉反应。因需要阳性钉螺获取尾蚴，应用常受到限制。

三、凝集试验(Agglutination test)

(一)间接血凝试验(Indirect heamagglutination test，IHA)

将寄生虫虫体可溶性抗原吸附于绵羊红细胞或醛化的人O型红细胞表面，使之成为致敏颗粒。然后用这种致敏颗粒与相应的抗体在一定条件下起反应，抗原和抗体的结合反应通过红细胞间的凝集而表现出来，直接用肉眼观察判断结果。血凝试验有几种类型，例如用特异性抗体致敏红细胞检测抗原称反向间接血凝试验(Reverse indirect heamagglutination test);预先用已知抗原或抗体中和待测标本，再加入相应的致敏红细胞，阳性者无凝集反应，称为间接血凝抑制试验(Indirect heamagglutination inhibition test)。

IHA操作简便、价格低廉、敏感性高、特异性强，已广泛应用于多种寄生虫病的辅助诊断和流行病学调查。该法用于肝吸虫病的检测，与粪卵符合率达68%～98%;用于弓形虫病诊断时与染色试验的符合率为90%左右;用于囊虫病的诊断已证明较免疫电泳的敏感性高，国内报告该法检测囊虫病患者血清，阳性符合率为89.6%～90%，假阳性率为1.5%～10%。但本试验存在致敏红细胞不稳定，重复性差，有一定的非特异性凝集，疾病治愈后可持续较长时间的阳性，不能检测抗体的亚类等缺点。采用纯化抗原致敏红细胞可提高本法的特异性、敏感性与重现性。醛化血细胞已有市售，有些试剂已商品化。但抗原的提纯和操作方法尚需标准化。

(二)胶乳凝集试验(Latex agglutination test，LAT)

基本原理同血凝试验。它是以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体吸附抗原或抗体，与相应抗原或抗体作用，在一定条件下发生凝集反应，形成肉眼可见的凝集块。本法在肺吸虫病、血吸虫病、棘球蚴病、弓形虫病等免疫诊断中均有应用。对于急性和慢性血吸虫病患者，阳性率分别为93.8%和89.5%;用于弓形虫病血清学检测与IHA和DT有较高的符合率。该法简便易行，干扰因素少，结果稳定，价格低廉，属中度敏感的试验方法，故适用于个例诊断及血清流行病学调查。

四、间接荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody test，IFA)

将荧光素(如异硫氰酸荧光素，FITC)与抗免疫球蛋白抗体(如羊抗人IgG)用化学方法结合起来，制成荧光标记第二抗体。当待测血清中的抗体与固相抗原结合后，用荧光标记第二抗体孵育，便形成免疫荧光复合物，借助荧光显微镜可见亮绿色荧光，表示存在相应的抗原抗体复合物。IFA可通过制备荧光标记抗体检测多种抗原抗体反应，既可检测未知抗体，又可检测未知抗原。IFA主要用于寄生虫病的快速诊断和组织切片中特异性抗原的检查与定位。由于该技术可直接在细胞水平或亚细胞水平上观察和鉴定抗原、抗体或免疫复合物，因而被广泛应用。IFA具有高度的特异性、敏感性和重现性，已应用于黑热病、疟疾、弓形虫病、卡氏肺孢子虫肺炎、贾第虫病、棘球蚴病及丝虫病等的血清学诊断、流行病学调查以及疫情监测，并取得较好效果。本法操作简单，荧光标记第二抗体已商品化供应，固相抗原制备容易。不足之处是需用荧光显微镜，结果判断带有主观性，且有非特异性荧光干扰。

五、酶免疫试验(Enzyme immune assay)

(一)酶联免疫吸附试验(Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)

将抗原或抗体与酶结合，使其保持免疫反应的特异性和酶的活性。用这种酶标记抗原或抗体与黏附在载体上的配体结合，再与相应的酶底物作用，使无色底物显示颜色，根据颜色深浅可定量测出抗原含量或抗体滴度。结果可用目测或用酶标阅读仪测定OD值。常用方法有间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。

ELISA已广泛用于多种寄生虫感染的诊断、血清流行病学检查和疗效考核，检测标本有宿主血清、脑脊液、乳汁、尿液、粪便滤液等，是一类具有高度特异性和敏感性的血清学检查方法。该法可检查抗体、抗原或免疫复合物，操作易自动化，结果可定量，适于批量样品的检测。可在多方面代替其他血清学方法。其敏感性可与荧光抗体技术及放射免疫测定相媲美，且简便经济，无放射性污染，由于可在多种载体(如凝胶、聚苯乙烯微量滴定板、硝酸纤维膜等)上进行反应，适用范围广。目前，国内外有多种诊断寄生虫感染的酶联试剂盒，可分别诊断血吸虫病、丝虫病、旋毛虫病、犬蛔虫病、弓形虫病等。ELISA克隆抗原及McAb的应用使该法更趋标准化和规范化。

1.间接法。

该法是国内应用最为广泛的一种ELISA。将抗原固定于载体(聚苯乙烯微量滴定板、琼脂糖小珠等)表面，加入待测血清孵育，然后洗去未结合血清成分，加入酶标记抗球蛋白抗体，使其形成抗原—抗体—酶标记抗体(或SPA)复合物，加入相应底物，在酶的催化作用下显示颜色，直接用肉眼观察或酶标仪检测结果。

2.双抗体夹心法。

用特异性抗体包被载体表面，将待测抗原与致敏的载体共同孵育，洗涤后加入酶标记特异性抗体，酶标记抗体即与载体表面的抗原抗体复合物相结合，加入底物显色后可判断是否存在特异性抗原。

3.竞争抑制法。

用于检测抗原或抗体。如将特异性抗体吸附于载体表面(致敏载体)，以酶标记抗原和待测抗原的混合液与致敏载体孵育，使酶标记抗原与待测抗原竞争特异性抗体。结合到致敏载体上的酶标记抗原，经底物催化后的显色深浅与待测抗原量成反比;将结果与仅含酶标记抗原的底物显色反应进行对照，两者OD值的差即代表待测抗原量。

(二)斑点酶联免疫吸附试验(Dot－ELISA)

该法以硝酸纤维膜(NC)或混合纤维素酯薄膜作为载体，替代聚苯乙烯等。NC膜具有较强的吸附蛋白质的能力，吸附稳定，可避免聚苯乙烯反应板批间差异对抗原吸附的影响。经酶催化后在膜上生成不溶性底物沉淀，形成有颜色的斑点，即为阳性反应。可用于检测抗体，也可用于检测抗原。试剂用量少，费用低，操作简单快速，肉眼即可观察结果，适宜基层和现场推广使用。如用光密度扫描仪测定可作定量分析。国内已广泛用于血吸虫病、疟疾、棘球蚴病、肝吸虫病、姜片虫病、囊虫病、弓形虫病、黑热病等的免疫诊断。

六、免疫酶染色试验(Immunoenzymatic staining test，IEST)

本试验的基本原理同间接荧光抗体试验，只是以酶代替荧光素。采用寄生虫各期虫体的冰冻或石蜡切片作为固相抗原，与寄生虫感染血清中特异性抗体结合形成免疫复合物后，再加酶标记抗体，用底物显色，肉眼或普通显微镜即能观察结果，IEST经济简便，更便于现场应用。且标本不易褪色，可长期保存，利于回顾检查。

取丙酮固定的抗原片，在3%H₂O₂溶液中浸泡15分钟以除去内源性过氧化物酶，用pH7.2 0.01mol/L PBS冲洗后，滴加PBS稀释的待检样品0.05ml置湿盒内在37℃下孵育30分钟，以0.05%聚山梨酯(吐温)PBS洗涤2次，蒸馏水洗涤1次。吹干后滴加稀释的酶结合物，同上孵育，洗涤、吹干，滴加底物溶液［pH7.6 0.05mol/L Tris－HCl 20ml，H₂O₂4ìl，二氨基联苯胺(DAB)10mg］，温育30分钟，流水漂洗，根据颜色反应判定结果。

IEST抗原用量省，简便易行，固相抗原片置20℃以下可长期保存，尤其适用于实验室内个例的诊断。此外，该法敏感性、特异性和重现性好，已广泛用于血吸虫病、肝吸虫病、丝虫病、囊虫病、肺吸虫病、弓形虫病等的实验室诊断和流行病学调查。目前所用抗原及其操作方法尚需标准化。观察结果时应注意排除背景显色。

七、酶标记抗原对流免疫电泳(Enzyme－linked antigen counter－immunoelectrophoresis，ELACIE)

该法是将酶标记与对流免疫电泳相结合的技术。将酶标记抗原与待测抗体置琼脂板中电泳，在电场中形成酶标记抗原抗体复合物，通过相应底物处理，出现清晰可辨的棕红色反应沉淀带。结果可目测，也可用光密度扫描仪记录。该法较常规对流免疫电泳敏感性高。初步用于血吸虫病、肺吸虫病、囊虫病等的诊断，取得较好效果。

八、酶联免疫印迹技术(Enzyme－linked immunoblotting technique，ELIB)

该技术又称免疫印渍或Western blot，是以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)、转移电泳、固相酶免疫试验3种方法合为一体的分析检测技术。它既结合了SDS－PAGE分离蛋白的高分辨率，又兼具ELISA的高度敏感性与特异性，能从复杂混合物中进行分离、提纯，一次性地检出和分析各种不同的活性组分，鉴定出微量抗原和低滴度抗体。因此，这是一种具有很好的应用前景的抗原分析和免疫诊断技术。

将可溶性抗原(2mg/ml)加等量样品缓冲液(pH0.8 0.5mol/L Tris－HCl缓冲液，含SDS、甘油、2－巯基乙醇和溴酚蓝)，以水浴煮沸3分钟。用13%凝胶(先配制30%丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺母液，比例为30∶0.8)浇板，作为分离胶;聚合后加入5%浓缩胶。将抗原样品缓缓加至浓缩胶上沿梳槽内，再加电泳缓冲液(pH8.3 Tris－甘氨酸缓冲液);上接正极，下接负极，每板以20mA电泳2～3小时，待指示剂溴酚蓝抵距胶板下沿1cm时停电，剥离凝胶，拟作转移电泳。

取一与凝胶板大小相同的NC膜置凝胶板下，排尽气泡，将两面垫以滤纸和海绵，夹于转移电泳槽内。加入转移电泳缓冲液(pH8.3 Tris－甘氨酸缓冲液，含20%甲醛)，胶板面接负极，NC膜面接正极，以90V电压转移电泳3小时。

取出NC膜，洗涤，切下标准分子量蛋白和一部分分离的寄生虫抗原NC膜，用0.1%考马氏亮蓝(R－250)染色，并适当褪色，然后观察分离效果。其余NC膜同IEST操作，观察、记录抗原—抗体反应带。

ELIB为一项高敏感、高特异、多信息量的检测方法，结合光密度扫描可定量测定某抗原组分。可用于分析寄生虫抗原，用于虫种分类，并可鉴定其生物学和免疫学特性。还可检测宿主体液内针对某种分子量抗原的抗体谱型及其动态变化，以达到寄生虫病诊断及其流行病学监测的目的，为寻找特异蛋白组分用于免疫预防提供依据。

九、放射免疫测定(Radioimmunoassay，RIA)

该法是将同位素标记与抗原—抗体反应相结合的微量检测方法。采用放射性同位素(如125I、131I、3H、14C、32P等)标记抗原或抗球蛋白抗体，然后与相应的特异性抗体或抗原抗体复合物起反应。RIA既保持了免疫技术的高度特异性，又利用了放射性同位素示踪技术的高灵敏度及能精确定量分析的优点，提高了检测的敏感性(可达pg水平)。同时该技术稳定性好，在质控较好的实验室批间误差小。现已用于多种寄生虫的抗原抗体检测，并发展了多种测定方法。但该技术存在放射性污染，且常用同位素半衰期短，使其应用受到了限制。具体方法有放射对流免疫电泳自显影(Radio－counter immunoelectrophoretic autography，RCIEPA)、放射变应原吸附试验(Radio－allergosorbent test，RAST)及竞争性RIA等。RCIEPA用于检测肺吸虫病、弓形虫病、血吸虫病，其敏感性明显高于常规对流免疫电泳。RAST用于检测蠕虫感染者血清IgE抗体，敏感而又简单;国内用以检测包虫病人IgE已取得较好效果竞争性。RIA检测疟疾，灵敏度达8个虫/106红细胞。

十、免疫金银染色法(Immunogold－silver staining，IGSS)

胶体金颗粒表面可与蛋白质形成非共价键结合而不影响蛋白质活性。采用金标抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)特异性结合，在显色剂作用下，金颗粒催化硝酸银离子还原成银颗粒，从而在抗原抗体复合物上形成光镜下可见的金银颗粒，提高了光镜下的可见度。本法主要用于免疫组化染色。

将氯金酸(HauCl₄)以还原剂(白磷、抗坏血酸、柠檬酸三钠、鞣酸等)制成颗粒大小不同的胶体金颗粒。用胶体金标记羊抗人IgG或SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)，将寄生虫切片抗原(石蜡或冰冻)置pH7.4 TBS缓冲液(0.05mol/L Tris－HCl，0.15mol/L NaCl)内洗20分钟。然后，将含有10%正常兔血清的TBS加于抗原，10分钟后弃去，无须洗涤。接着，再加不同稀释度的待测血清，于37℃孵育2小时，用pH7.4 TBS液洗涤3次，再用pH8.2 TBS(0.02mol/L Tris－HCl，0.15mol/L NaCl)洗涤3次。加含10%正常兔血清的TBS，10分钟后弃去，滴加稀释后的金标第二抗体，孵育后分别用pH8.2 TBS、pH7.4 TBS及蒸馏水洗涤。最后将切片在避光下置显影液(1%明胶60ml，pH3.5柠檬酸缓冲液10m l，含1.7g对苯二酚的水溶液30ml，临用前加含42.5mg硝酸银2ml)，作用35分钟后用蒸馏水冲洗，吹干后镜检。

在国内，IGSS已用于血吸虫病、肝吸虫病、囊虫病的免疫诊断及寄生虫抗原定位，并显示出高度的特异性和敏感性，是一种具有良好应用前景的新型标记技术。此外，还有在IGSS基础上的改进技术，如斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)和斑点免疫层析试验(DICA)等。