第五节　原虫的人工培养

当患者被疑为某种寄生虫病而病原检查为阴性时，可考虑作寄生虫人工培养。目前，在医学检验中应用较多的是溶组织内阿米巴、阴道毛滴虫和杜氏利什曼原虫的人工培养。

一、溶组织内阿米巴

(一)常用培养基

1.营养琼脂双向培养基。

【培养基成分】

固相部分:牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，琼脂15g，液体1 000ml(见液相部分)。液相部分:氯化钠8g，氯化钾0.2g，氯化钙0.2g，氯化镁0.01g，磷酸二氢钠2g，磷酸氢二钾0.3g，蒸馏水1 000m l。分别在氯化钾与氯化钙中加少许蒸馏水，并分装两个小瓶内，高压灭菌(103.4kPa 20分钟)，冷却后，再合并在一起。

【配制方法】

取液相部分2 000ml、固相部分1 000ml，待固相部分经沸水浴(2～3小时)完全溶解后，观察有无残渣。若有，须经4层纱布过滤。趁热将滤液分装试管，每管5ml，加棉塞，高压灭菌后制成斜面，冷却后置4℃下备用。接种前，每管加液体部分4.5ml，灭活小牛血清0.5ml，消毒米粉20mg。亦可加青霉素2 000U/m l、链霉素2mg/m l(下同)，以控制细菌繁殖。

2.洛克(Locke)液鸡蛋血清培养基。

【培养基成分】

洛克液(氯化钠9.0g，氯化钙0.2g，氯化钾0.4g，碳酸氢钠0.2g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1 000ml)70ml，鸡蛋4个。

【配制方法】

先配制洛克液，55.1kPa高压灭菌20分钟。氯化钙与氯化钾溶液制作方法同上法。取鸡蛋用肥皂水刷洗，再用70%酒精消毒蛋壳后，以无菌玻璃棒敲碎蛋壳，将蛋清、蛋黄倾入装有50ml洛克液的烧瓶内，加玻璃珠充分振摇，使内容物混匀，分装至消毒试管内，每管约5ml，斜置并加热至70℃约1小时灭菌。翌日及第三日各以80℃及85℃加热1小时灭菌，冷却后置4℃冰箱储藏备用。接种前每管加洛克液4.5ml，马血清0.5ml，无菌米粉20mg。

(二)培养方法

1.取材。

粪便、肝穿刺物、肠黏膜或其他病变组织均可用作培养材料。材料要新鲜，粪便不能与尿、化学药品等混合，脓血便最好在15分钟内接种，成形粪便可在1～2天内接种。

2.接种与培养。

取脓血便、肝穿刺物或稀便0.5ml，含包囊的成形便则取黄豆大小，接种至试管内并与培养液混匀;或将粪便以自然沉淀法浓集包囊，吸取沉淀物0.5ml接种。试管置37℃温箱中培养，24、48及72小时后观察有无阿米巴生长。

二、黑热病原虫

(一)常用培养基

常用三N(Novy，MacNeal和Nicolle)培养基。

琼脂14g，氯化钠6g，加双蒸馏水900ml，煮沸溶解后分装试管，每管3～5ml，用棉塞紧塞瓶口，103kPa高压灭菌。取出后待冷却至48℃时，每管加入培养基1/3量的无菌脱纤维蛋白兔血，混匀后斜置冷却，使呈斜面。每管加洛克液0.2～0.3ml，使斜面上有一薄水层，并用无菌橡皮塞置换原先的棉塞，以防水分蒸发。置37℃温箱中培养24小时，证明无菌后即可使用;或贮于4℃冰箱备用。接种前加青霉素、链霉素少许。

(二)培养方法

取患者骨髓或淋巴结以及其他疑有黑热病病变的活组织穿刺液或皮肤组织，与少量洛克液充分混匀后接种于培养基，置22℃～25℃温箱中培养。在10～12天后，取少许培养物作涂片，行吉姆萨染色后镜检，看有无前鞭毛体生长。若为阴性，应继续培养至1个月，作进一步检查后报告结果。

三、阴道毛滴虫

(一)常用培养基

1.肝－胨－糖培养基。

兔肝15g，蛋白胨2g，葡萄糖0.5g，蒸馏水100ml。先将兔肝剪碎，装入广口瓶内，加蒸馏水100ml。混匀，煮沸30分钟。通过4层纱布过滤，补足蒸发水分后再过滤，便可得到清亮的肝浸液。在肝浸液中加入上述其他成分，待完全溶解后，将pH调至5.7。分装试管(每管5ml)，用棉塞塞紧。然后，以55.1kPa高压灭菌20分钟，冷却后置37℃温箱中24小时。证明无菌后，即在4℃冰箱内保存备用。临用时，每管加灭活小牛血清2ml及青霉素、链霉素少许。

2.大豆蛋白胨培养基。

大豆2g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，蒸馏水100ml。先将大豆在温蒸馏水中浸泡24小时，膨胀后去皮、加热煮烂，再补足蒸发失去的水分。用滤纸过滤后，将pH调至5.0。然后加入其他成分并加热，使其完全溶解。分装入试管(每管5ml)，经103kPa灭菌15分钟后在4℃冰箱内保存备用。临用前，每管加7.5%葡萄糖液0.5ml，灭活小牛血清1ml，青霉素、链霉素少许。

(二)接种与培养

以无菌棉拭子从阴道后穹隆取分泌物，接种于上述培养基，置37℃温箱培养。24～48小时后，吸取管内沉淀物作涂片或涂片染色检查。