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4.采血器械使用前必须严格消毒，做到一人一针，避免交叉感染。采血时，须注意无菌操作。

二、疟原虫检查

(一)载玻片清洁法

【清洁液配制】

先将1 000ml蒸馏水置于耐酸耐热容器中，加入重铬酸钾80g，用玻璃棒搅拌，使之溶化，然后取硫酸100ml，沿玻璃棒徐徐加入水中，边加边搅拌，切勿过急，并防止硫酸溅出，冷却后加盖存放。

【载玻片清洁法】

血涂片检查是诊断疟疾的基本实验诊断方法，制作血涂片的载玻片必须清洁无油。新的载玻片放入清洁液内1～2天，取出后用清水(蒸馏水更好)冲洗，再经95%酒精浸泡1小时以上，取出擦干。用过的旧载玻片，先用肥皂水逐片洗涤干净，清水冲洗。再用清洁液和95%酒精处理后使用。

在普查时，一般无法考虑采血时间。在临床上，对现症病人一般可随时采血，但为了提高检出率，就应当考虑采血的适当时间。对典型发作的间日疟及三日疟患者，应选择发作后数小时至10余小时采血为好。此时疟原虫发育至环状体乃至晚期滋养体，虫体大，疟色素已形成，受染红细胞也出现变化，有利于原虫的检出，对诊断和鉴别诊断均有益处。恶性疟原虫从晚期滋养体以后是在皮下、脂肪和内脏微血管中发育的，通常在外周血液中不易查到，而环状体则往往随时都能从患者外周血液中查到，故在发作初期就可采血检查，但最佳采血时间是在发作10小时内，因此时原虫发育已达到高峰，且尚未完全进入脂肪层及内脏微血管内。不过，外周血中配子体出现较晚，通常在环状体出现1周后方出现于外周血液。

对难以选择采血时间、常规血液检查未查到原虫的疑似疟疾的患者，可用1%麻黄素0.5～1ml皮下注射，15分钟、30分钟和60分钟各采血1次，可以查到较多的疟原虫。亦可用烟酸作恶性疟原虫诱激试验，成人顿服100～200mg，1～7岁25～50mg，8～15岁50～100mg，60分钟后外周血内原虫数量达到高峰。间日疟患者服烟酸后15分钟，原虫数上升，120分钟达到高峰，此时采血检出率高。

从患者耳垂或指尖(以左手无名指为宜)取血。婴儿喜吮吸手指，容易引起感染，通常从大拇趾第二趾骨腹面针刺采血。足底部血管密积，但局部角质化后不宜采用，采血前应与患儿家长说明情况，争取合作，充分固定患儿身体，以利采血。

最好用一次性采血针，亦可用三棱针或注射针头。使用前必须消毒，以防交叉感染。采血时，先用75%酒精棉球消毒取血部位皮肤，待干后用左手拇指和食指捏住采血部位，使局部皮肤绷紧。然后，右手持针迅速刺入皮肤约1～2mm深，待血液流出或轻轻挤出血滴，这时迅速取血作涂片。采血完毕，再用干棉球轻压伤口止血。

1.薄血膜制作。

取一张载玻片作血涂片，用左手拇指和中指夹持其两端(手指不可接触载玻片表面)或平置桌上。再选一张端缘平整、光滑的载玻片作推片，以其端缘中点接触刺血点上的血滴，取血1滴(约1～2μl血量，相当于1/4火柴头大小)，使血滴与作为血涂片的载玻片接触，并与载玻片呈30°～45°夹角，待血滴沿推片边缘向两侧展开后，立即由右向左迅速推成薄血膜(图17－8)。也可用作血涂片的载玻片表面接触刺血点血滴，取血1小滴，然后用推片一端置于血滴左方，慢慢向右移动推片，接触血滴，待血沿推片边缘展开后，再向左推去。理想的薄血膜要求红细胞均匀地铺成一层，无裂痕，呈舌状。

推片时用力和速度要均匀，不能中途停顿或来回重复推片，以免造成血膜不匀。制作厚血膜时，亦只能向一个方向旋转、涂制。

2.厚血膜制作。

用推片的一角接触刺出的1小滴血(血量约4μl，相当于火柴头大小)，置载玻片上(图17－8)，并从内向外作旋转(只能朝一个方向)涂布，作成直径为0.8cm、厚薄均匀的圆形血膜，将标本平置在实验台上。待自然干燥后，在血膜上滴加蒸馏水，使红细胞溶解(溶血);当血膜呈灰白色时，即将液体倾去并晾干。

薄血膜经固定、染色，红细胞完整，其内各期疟原虫形态典型，便于虫种鉴别。但若血内原虫密度太低时，则不仅费时，而且很容易漏检。厚血膜用血量稍多，原虫密度较高，故容易快速查到;但由于制片时红细胞已被溶解，原虫虫体皱缩或重叠，胞质变形或断裂，不易辨认。因此，最好采用厚、薄血膜同片制作法。这样，既便于较快地在厚血膜中查到疟原虫;又能在鉴别虫种有困难时，再查薄血膜，以进一步确定虫种。

厚血膜亦不宜过厚，且必须干透后才能溶血，否则血膜很容易脱落。但血膜过薄，则会降低检出率。

3.厚薄血膜同片制作。

用目测法将载玻片从右到左等分成6格，在第3格中央涂制厚血膜，在第4格前缘至第6格中部之间推制薄血膜(呈舌状或长条形)，第1、2格则用于贴标签(图17－8)。

通常，应先推制薄血膜，以免血液变稠后难以推开。

1.瑞氏染色法(W right's staining)。

本法操作简便、快速，临床上经常使用。但因甲醇易于挥发，如掌握不当可在血膜上产生沉淀，妨碍镜检。此外，染色结果不太稳定;在较热的环境中易于褪色，保存时间较短。

瑞氏染剂粉0.2～0.5g，甘油3ml，甲醇97ml。将染剂粉置研钵中，加甘油充分研磨，然后加少量甲醇，研磨后倒入棕色玻璃瓶内，余下的甲醇再分几次冲洗研钵中的染液，倒入瓶内，塞紧瓶口，充分摇匀，置室温下1～2周后过滤使用，或放入37℃温箱24小时后过滤备用。

【磷酸缓冲液配制】

1/15mol/L磷酸氢二钠原液:Na₂HPO₄9.464g或Na₂HPO₄·2H₂O 11.867g或Na₂HPO₄·7H₂O 17.872g或Na₂HPO₄·12H₂O 23.877g，蒸馏水1 000ml;1/15mol/L磷酸二氢钾原液:KH₂PO₄9.073g，蒸馏水1 000ml，临用前将上述原液配成不同pH值的磷酸缓冲液(表17－4)。

取制作好的血片，在血膜两端用玻璃蜡笔各画一竖线，滴加瑞氏染液数滴(厚血膜需先溶血)，使其布满血膜，染液中含甲醇，约0.5～1分钟将血膜固定，然后加等量缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使之与染液混匀，很快液面出现灿铜色膜，约经3～5分钟染色后，用缓冲液、蒸馏水或自来水冲洗。

切勿倾去染液再用水冲洗，以免血膜上沉着染料颗粒，影响镜检。如厚、薄血膜涂在同一张载玻片上，应先在厚、薄血膜中间用特制玻璃蜡笔画线，然后在薄血膜上滴甲醇固定;在厚血膜上滴蒸馏水溶血。待血膜干后，二血膜一起染色。

2.吉姆萨染色法(Giemsa's staining)。

本法染色效果良好，对厚血膜尤佳。经稀释后的染液对厚血膜兼有脱血色素和染色的双重作用，染色效果稳定。染色后，原虫染色质粒与细胞浆红蓝分明，很少出现沉淀，不易褪色。适用染大批血片标本，供教学使用，但染色时间较长。

吉姆萨染剂粉1g，甘油50ml，甲醇50ml。将染剂粉置研钵中，加少量甘油，充分研磨，再边加甘油边研磨，直至甘油用完。然后加少量甲醇，研磨后倒入棕色瓶中，剩余的甲醇分几次冲洗研钵中的染液，全部倒入瓶内，塞紧瓶塞充分摇匀，置65℃温箱内24小时或室温下1周后过滤，即成原液。

取吉姆萨染液原液，用pH7.0～7.2的磷酸缓冲液稀释10～20倍。厚血膜不需固定，薄血膜则先用甲醇(如厚血膜在同一张载玻片上，切勿延及厚血膜)固定，干后滴加用缓冲液稀释(1∶20)的吉姆萨染液，布满血膜(如大批染片，可置入染色缸)，染色30分钟。冲洗、晾干后镜检。

稀释的染液，宜现用现配，否则易产生沉淀，影响染色效果。在大批染片时，应根据当时条件(如血片情况、室温等)，先试染少量血片。

3.荧光素吖啶橙染色法(Acridine orange staining)。

荧光素通过渗透、吸附和化合等作用，与原虫或组织细胞的不同成分结合而带有荧光。在暗室内经荧光光源激发，使发出不同荧光的虫体在镜下易于辨认。

吖啶橙1g，蒸馏水或pH7.0的磷酸缓冲液100ml，混匀即成原液。静置2～3周，使染料充分溶解，滤入棕色瓶，塞紧瓶塞，在4℃冰箱中可保存1年以上。临用时取10ml pH7.0磷酸缓冲液，加吖啶橙原液0.1ml，配成0.01%的吖啶橙染液，再在每毫升染液中加1滴甘油，以延缓干燥过程。染液宜贮存于棕色瓶中。

薄血膜先用甲醇固定;而厚血膜(比常规厚血膜用血量减少1/2，故俗称半厚片)需先行溶血，干后再用甲醇固定。然后取0.01%吖啶橙染液滴在血膜上，染色2～3分钟后加0.1mol/L氯化钙，分化30秒钟，水洗;加磷酸缓冲液，盖上盖玻片，置荧光显微镜(高倍)下观察。含脱氧核糖核酸的疟原虫细胞核与白细胞的核发出黄绿色荧光，含有核糖核酸的疟原虫的细胞质和淋巴细胞的细胞质发出橙红色荧光，而疟色素和红细胞无荧光发出，网织红细胞仅呈暗淡的灰红色，血小板呈暗淡的灰绿色。

用本法镜检标本时，应在暗室进行。

1.薄血膜法(Thin film method)。

在染色薄血膜中判定疟原虫，主要依据以下三个特征:①原虫寄生于红细胞内，但少数成熟裂殖体、配子体寄生的红细胞已破裂者除外;②原虫具有被染成紫红色的胞核和浅蓝色的胞质;③晚期滋养体及其以后的各期疟原虫，胞质内含有棕褐色的疟色素颗粒。

在排除了易与疟原虫相混淆的类似物后，应根据各种疟原虫的形态特征，鉴别虫种及发育阶段。若感染度轻，采用薄血膜法易于漏检。

2.厚血膜法(Thick film method)。

厚血膜中疟原虫比较集中(一个视野可见到的细胞数约相当于20个薄血膜视野)，但厚血膜经溶血后，红细胞轮廓消失，原虫皱缩变形，虫体比薄血膜中的略小，有的原虫胞质着色很深，胞核模糊不清，初学者较难识别。检验人员必须经过一段时间的严格训练，在充分掌握薄血膜中各种疟原虫的形态特征后，才能认清厚血膜中的疟原虫。

在同一片制作厚、薄血膜时，应先检查厚血膜上的疟原虫，以达到快速目的;若鉴定虫种有困难，可再仔细观察薄血膜，以提高镜检效果。

三、微丝蚴检查

检查血液中的微丝蚴，是确诊丝虫病的主要方法，采血时间应在夜间9时至翌晨2时为宜，采血量多则检获率也高，采血方法与检查疟原虫的采血相同。

(一)鲜血片法(Fresh film smearing)

夜间从耳垂或指尖取血1小滴于载玻片上，加1滴生理盐水，覆以盖玻片，置低倍镜下检查，可见活动的微丝蚴。此法用血量少，但检出率也低，且难以确定虫种，多用于现场宣传教育。

用低倍镜检查时，采光不宜过强。

(二)厚血膜法(Thick film method)

夜间从耳垂或指尖取血3大滴(约60μl)，滴在干净的载玻片中央，用另一载玻片一角将血液涂成1.5cm×2.5cm的长方形或直径1.5～2.0cm的圆形厚血膜，边缘整齐，厚薄应均匀。自然晾干，注意防止落上灰尘或被昆虫舔食。加水溶血，即可镜检。低倍镜下微丝蚴为细长、无色透明、头端钝圆、尾端尖细的呈不同形状弯曲的虫体，其粗细、大小相似。

应与植物纤维(棉花纤维)区别，植物纤维长短粗细不等，两端呈折断状，折光性不均匀，内部常有纵形条纹。如需鉴定虫种，血片应经染色后镜检，常用染色方法如下。

1.瑞氏或吉姆萨染色法(W riht's or Giemsa's staining)。

具体方法同疟原虫的检查。瑞氏染色法操作简单、快速，适合临床化验室使用。吉姆萨染色法所染的微丝蚴内部结构较清晰，有利于虫种鉴定。

2.德氏苏木精染色法(Delafield's hematoxylin staining)。

此法所染微丝蚴，其内部结构比较清晰，便于虫种鉴定，且标本可长期保存。

A液:苏木精4g，95%或纯酒精10ml;B液:硫酸铝铵10g，蒸馏水100ml;C液:甘油25ml，甲醇25m l。将B液逐滴加入装有A液的棕色瓶中，瓶口用数层纱布扎住，暴露于空气和阳光下，使之氧化，2～4周后过滤，再加入C液，直至变为暗色，再过滤一次。此液密封可保存数年。临用时以蒸馏水稀释10～20倍。如急用，加数滴过氧化氢或少量(约0.2～0.3ml)碘酸钾或碘酸钠于A、B液中，曝光3～4天，过滤后加C液即可使用。

将经溶血、固定的厚血膜放入装有稀释染液的染色缸中，染色2～6小时或过夜。如将染液加热到40℃，染25分钟即可。如着色过深，可用0.5%～1%盐水溶液褪色至染色适度为止。如染色过浅，可重染或浸入1%氨水内矫正。矫正后经水洗、晾干镜检。还可经各级酒精脱水、二甲苯透明、中性胶加盖玻片封固，则标本可长期保存。

3.硼砂美蓝染色法(Borax－methylene staining)。

美蓝2g，硼砂3g，研磨后加蒸馏水100ml，振荡。待充分溶解后，用滤纸过滤即成原液。使用时，用蒸馏水将原液按1∶20稀释成5%的染色液。

厚血膜经溶血，晾干后用甲醇固定，然后浸入5%染液内5～10分钟，水洗，晾干，镜检。若染色过深，可在0.2%盐酸溶液中褪色至适度。

(三)离心浓集法(Centrifugal concentration method)

取静脉血2ml，迅速置入盛有3.8%柠檬酸钠(0.4ml)的离心管内;充分混合后取抗凝血1.2ml，移入另一10ml离心管内，加蒸馏水至10ml，并按住管口倒转数次。溶血后，以3 000r/min离心5～10分钟。倾去上清液，再加0.05mol/L氢氧化钠溶液至10ml，用力振荡数次，放置5～10分钟，使纤维蛋白凝块溶解，再离心10分钟。最后，用毛细吸管移去上清液，取沉渣作涂片镜检。本浓集法适用于血中微丝蚴较少的患者。

若因条件限制，也可将2ml血置于10ml离心管内，直接加入8ml蒸溜水溶血，离心后取沉淀物镜检。

(四)薄膜过滤法(Thin film filtration method)

过滤器用两块长6cm、宽4cm、厚0.4cm的铜板制成。上面铜板中央部打一小孔，孔上焊接一注射器针头，下面铜板中央开一直径为16mm的圆孔。铜板中央放1块滤纸作衬垫(使用时用生理盐水湿润)，滤纸上放一孔径为3mm或5mm、直径25mm的薄膜。两块铜板间用螺丝固定、密封。若薄膜孔径为3mm，便称为核孔过滤浓集法;若薄膜孔径为5mm，则称为微孔过滤浓集法。

【哈(Harris)氏苏木精染液配制】

A液:苏木精1g，95%或纯酒精10ml;B液:钾明矾(铵明矾)20g，氧化汞0.5g，蒸馏水200m l。将明矾研碎置于含200m l蒸馏水的烧杯中，微火煮沸20分钟，同时将A液放入另一烧杯中煮沸数分钟，直至溶解。然后将A液徐徐滴入正在煮沸的B液中。加完后，离开火焰，慢慢加入氧化汞，再煮沸3～4分钟，将烧杯移至冷水中快速冷却，次日过滤于棕色瓶中。

用含有5%的柠檬酸钠0.1ml的10ml注射器抽受检者静脉血1ml，摇动注射器，使血与抗凝剂混匀，将带有针头的注射器放入采血箱内过夜。次日再抽蒸馏水9ml，摇匀至血液完全溶解。去掉针头，再将注射器头插入过滤针栓孔，慢慢推动注射器针芯，使溶血的悬液通过滤器。然后用该注射器吸生理盐水2ml，冲洗滤器，反复3次，打开滤器，取出核孔或微孔薄膜，置于湿毛巾上，滴加蒸馏水清洗薄膜两次。将薄膜晾干后，放入盛有哈氏苏木精液的玻皿中，染色5分钟或加温(37℃)染色1～3分钟，水洗。干后置载玻片上，滴加二甲苯透明，加盖玻片镜检。为使溶血完全而快速，可用洗洁精或1%白皂素代替蒸馏水。

本法微丝蚴检出率高于厚血膜法，尤其低密度微丝蚴阳性者更为显著，对考核防治效果及流行病学调查有重要意义。但核孔或微孔薄膜价格较贵，且操作复杂、需静脉采血，不及厚血膜法简便和易为群众接受。

对宣布基本消灭丝虫病的地区进行复查、验收时，应采用微孔薄膜过滤浓集法进行检查;对宣布消灭丝虫病的地区进行复查、验收时，则应采用核孔薄膜过滤浓集法进行检查。

(五)海群生白天诱出法(Hetrazan day traping)

在白天给受检者服海群生2～6mg/kg(成人顿服100mg)，15分钟后外周血液中微丝蚴密度逐渐上升(2小时后下降)，在服药后50分钟左右采血最为适宜。但此法的微丝蚴检出率仍比夜间采血的低，轻度感染者容易漏检。

个别受检者服海群生后可出现副反应，如头晕、头痛、腹痛等。一般在数小时后，即自行缓解。

四、骨髓中杜氏利什曼原虫检查

(一)髂骨穿刺法

患者侧卧，暴露髂骨部位，选髂前上棘后1cm处(可摸到一凹陷)为穿刺点，用碘酒、酒精作局部消毒。然后局麻，并根据患者年龄大小，选用17～20号带针芯的干燥无菌穿刺针刺入皮下。当针尖触及骨面后，再缓缓垂直刺入骨内0.5～1cm深。当针进入骨髓腔时，即有阻力突然消失的轻微感觉，此时在穿刺针后接牢干燥无菌的2ml注射器，抽取少许骨髓液，立即做成骨髓涂片，晾干后再染色、镜检。

骨髓涂片应薄而均匀，用甲醇固定后再作染色、镜检。

(二)棘突穿刺法

患者面朝椅背跨坐椅上，弓腰露出椎骨棘突，选取最明显的棘突穿刺。通常以第十一、十二胸椎或第一、二腰椎棘突最为适宜。消毒皮肤后，以左手拇指固定穿刺部位，将针由棘突尖垂直刺入棘突。针刺深度因年龄而异，5岁以下者约0.3～1.0cm，5岁以上者约1.0～1.5cm。用上法抽取骨髓液少许，涂片、干燥、固定、染色、镜检。