第四节　自然杀伤细胞的发育(Maturation of Natural Killer Cell)

在淋巴细胞中，有一类无T细胞和B细胞特征性表面标志的淋巴细胞，其形态学特征为胞浆内有许多嗜苯胺颗粒，故又称其为大颗粒淋巴细胞(large granular lymphocyte，LGL)。此类细胞以天然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)为代表，某些学者把它们称为与T细胞和B细胞并列的第三类淋巴细胞，是一类具有自发细胞毒性活性的细胞，由于能够迅速溶解小鼠体内的特定肿瘤细胞而被发现。

NK细胞通过速发效应(immediate effect)对靶细胞进行杀伤，无致敏过程，在体外与靶细胞混合后4小时内即发挥杀伤效应。NK细胞杀伤靶细胞的机制与CTL相似。NK细胞的靶细胞包括肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞以及机体某些正常细胞。因此NK细胞具有抗肿瘤、抗感染、免疫调节等功能。此外NK细胞亦参与移植排斥反应、自身免疫病和超敏反应的发生。

一、NK细胞的来源

NK细胞和所有的HSCs来源的细胞一样，均是由骨髓HSC分化发育而来，其发育、成熟过程依赖骨髓微环境，而不依赖于胸腺。人类和小鼠NK细胞主要分布于外周血和脾脏，在淋巴结以及其他组织内也有少量NK细胞存在。1998年有学者首度从正常肝脏移植标本中发现人肝脏含大量NK细胞，可达肝脏淋巴细胞总数的30%以上，其发生机制和生物学意义目前尚不清楚，推测与“固有免疫”有关。人外周血中，NK细胞占淋巴细胞总数的5%～7%。与B细胞相比，NK细胞与T细胞在个体发生上更为接近。例如：NK细胞为CD2、CD8阳性；表达IL-2R，在IL-2刺激下可增殖；活化的NK细胞可产生IFN-γ；表达Fc ε RⅡ；人类胚胎未成熟NK细胞可表达CD3的所有4条链的基因，成熟NK细胞受IL-2激活后仍可再表达CD3分子，提示NK细胞在个体发生更接近T细胞。未成熟NK细胞表达CD3的能力强于成熟NK细胞，提示NK细胞早期发育中更接近于T细胞。但不发生T细胞受体基因的重排。由于NK细胞所承担的细胞毒效应与CD8⁺CTL有相近之处，以及NK细胞分泌细胞因子的种类及数量又与CD4⁺Th细胞相近，故学者们倾向于认为NK细胞和T细胞为个体发育上关系十分接近的两类细胞。

二、NK细胞发育场所

骨髓为NK细胞分化发育的场所。骨髓CD34⁺CD7⁺DR⁺的前体细胞经长期培养后可分化为NK细胞，其CD34抗原在分化为NK细胞时，CD34抗原消失，代之而来则为CD2、CD16和CD56的标志。HSCs分化为NK细胞时必须有IL-2存在，但与IL-7和干细胞因子(SCF)共存时，NK细胞的发育分化与扩增将大幅度增加。由于IL-2缺陷小鼠中NK细胞仍可正常发育，以及骨髓基质细胞并无IL-2分泌，寻找NK分化所必需的调节因子尤为重要。近期发现骨髓基质细胞可表达IL-15mRNA，长期培养的骨髓基质细胞上清液中含IL-15。CD34⁺的HSC细胞体外培养中，单独IL-15刺激则可以促发其向NK细胞分化。

三、NK细胞分化发育过程与表型关系

体外实验过程中，对HSCs来源的NK祖细胞培养发现，该类细胞分化有两个较显著的阶段：第一阶段，NK祖细胞(NK progenitor)和flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)、干细胞因子、IL-7共同培养，能够发育为一种IL-15应答的NK祖细胞；第二阶段，该类细胞在IL-15刺激下，可以分化为功能性的NK细胞(具有溶细胞毒性)，并具有成熟NK(mature NK cell，mNK)细胞某些特征性的表面标志分子。对成年小鼠研究发现，骨髓中最早期定向发育为NK前体细胞(earliest committed precursors to the NK lineage，NKP)的表型为Lin^－CD122⁺NK1.1^－DX5^－Ly49^－；NKP细胞在体外与胎儿胸腺组织共培养时，能够发育为mNK。研究还发现未成熟NK细胞(immature NK cell，iNK)中一种细胞亚群的表型为CD122⁺NK1.1⁺DX5^－(CD49b)；iNK和NKP一样，均无细胞毒性，并低量表达Ly49。骨髓中尚有一类与mNK细胞表型相同的亚群，表型为CD122⁺NK1.1⁺ DX5⁺Ly49⁺；诸多事实表明，NK细胞的发育过程非常复杂，具有异质性。

最近，有人对来源于骨髓、肝、脾的NK细胞通过表型标志(如CD11β、CD43、CD94等)、溶细胞能力和IFN-γ进行分析，将NK细胞的发育过程区分为六个阶段，分别为A、B、C、D、E、F(表10-2)。阶段A：NKP为一种初始细胞；阶段B：iNK细胞，表达NK1.1、D94和NKG2，不表达DX5、Ly49，没有明显的细胞毒性；阶段C：iNK细胞开始表达Ly49受体，大部分表达CD117(即干细胞生长因子受体，SCFR)；阶段D：由于DX5的表达，开始进入成熟细胞阶段；阶段E：成熟NK细胞，CD43低表达，CD11β高表达。阶段F：则是高表达CD11β、CD43。成熟NK细胞具有细胞毒性，受刺激后合成IFN-γ，成熟NK细胞通过血液输送到外周组织，如肝、脾等。

某些转录因子是NK细胞发育和功能分化的必要前提。通过转录因子(transcription factor，TFs)分类，可将发育的NK细胞分为三个组(表9-2)。第一组表达锌指蛋白(Ikaros)、E26转录因子-1(Ets-1)、PU.1(系Ets家族中最重要的转录因子)和Id2，并认为是体内维持NK细胞正常增殖数量的必要条件；第二组表达Gata-3、T-bet和IRF2(IFN regulatory factor-2)。该类TFs初次出现于骨髓中突变的NK细胞，以及向外周迁移的NK细胞。第三组TFs表达至少包括MEF(myeloid elf factor，MEF)、MITF(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)和CEBP-γ(CCAAT/enhancer binding protein-γ，CEBP-γ)。当该类TFs缺失时，NK细胞发育不受影响，但是成熟的NK细胞的功能却显著削弱。

需要说明的是，NK细胞在人体内发育过程中的调控因素尚无定论，NK细胞的定居、迁徙和作用机制均有待深入研究。

表9-2　NK细胞发育过程分类

四、成熟NK细胞表型

NK细胞属细胞体积较大的淋巴细胞群体，其直径为10～16μm，形态上也具有异质性，是不均一的细胞群体。NK细胞表面标志多为与其他免疫细胞所共有，而很少为NK细胞所特有。小鼠NK细胞表达NK-1、Asiolo GM1、Thy-1和Lyt、Qa、Ly49等抗原。目前常用于检测人NK细胞的表面标志有(表9-3)：

表9-3　人NK细胞的表面标志

①CD16(又称Leu抗原)，是NK细胞表面一种低亲和力IgG Fc受体(Fc γ RⅢ)，此分子亦表达于中性粒细胞和嗜碱粒细胞表面；

②CD56(又称Leu19或NKH-1抗原)，是一种糖蛋白，此分子亦表达于T细胞表面；

③CD57(HNK-1、Leu-7)、CD2(OKT-11、Leu-5)、CD8、P58、P70、P30等(表10-3)。

尽管NK细胞来源于骨髓干细胞，与T、B细胞有共同前体细胞。但是，至今为止，NK细胞分化途径的详细机制尚不清楚。