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一、病毒的抗原检测（胶体金法检测粪便中诺如病毒抗原）

（一）临床意义

诺如病毒（NoV）是引起腹泻的主要病原体之一，常在社区、学校等场所集体暴发，尤其对儿童可导致水、电解质紊乱，严重危害患儿身心健康其至危及生命，在临床越来越受到重视。该病毒主要来源于粪便，具有高度传染性，对其中病毒抗原的检测是诊断人类诺如病毒感染的特异性方法，可为临床提供有价值的依据。

（二）目的要求

掌握胶体金法检测粪便中诺如病毒抗原的操作方法、结果判断及临床意义。

（三）器材与试剂

1.标本　待检粪便。

2.材料　测试卡20份，样本收集管（含样本稀释液）20支等。

（四）步骤与方法

1.原理　诺如病毒检测试条是以双抗体夹心法为基础，采用免疫层析金标记技术，快速检测患者粪便中诺如病毒抗原。检测时一个抗体吸附在硝酸纤维素膜（NC膜）上，另一个抗体结合于胶体金颗粒表面，当粪便标本中含有诺如病毒抗原时，先与NC膜上面抗体结合，然后与金标记抗体液反应，于是形成抗体-抗原-金标记抗体的夹心复合物。并呈现出紫红色沉淀线即可确证。

（1）用样本收集拭子从大便标本中收取大约50 mg的样本。

（2）打开样本收集管，插入拭子。

（3）搅动拭子直到样本溶入样本稀释液中，然后丢弃拭子。

（4）从包装盒里拿出测试卡，平放于干燥平面上。

（5）将样本收集管摇匀后，吸取一定量的样本上清液，滴加3～4滴（120～150 μL）到测试卡加样孔中。

（6）室温下10～20 min内报告结果。

（7）结果观察：

阴性结果：在反应窗内只出现质控线C带紫红色线。

阳性结果：在反应窗内出现检测线T带和质控线C带两条紫红色线。

无效结果：反应窗内在测试后不出现紫红色线，表明测试无效，建议使用新的测试卡。

（五）注意事项与小结

（1）在规定的观察时间内，无论色带深浅均判定为阳性结果。

（2）为防止引起医院内感染，对送检粪便样本及实验废弃物均视作生物危险品处理。

（1）免疫层析金标记技术的基本步骤有哪些？

（2）免疫层析金标记技术的注意事项有哪些？

二、病毒的抗体检测（ELISA检测HIV抗体）

（一）临床意义

酶联免疫吸附实验（ELISA）通过对抗原或抗体的酶标记，利用酶反应的敏感度和抗体的特异性，在临床快速病原检测中得到广泛应用。ELISA主要有两大类型：一是检测抗原的ELISA，即通过特异性抗体与固相载体结合，检测样本中相应的病毒抗原；二是检测抗体的ELISA，即通过抗原与固相载体结合，检测样本中相应的特异性抗体。本实验是将HIV抗原包被于固相基质表面用以检测患者样本中相应的HIV特异性抗体的水平。

（二）目的要求

掌握ELISA检测HIV特异性抗体的操作方法、结果判断及临床意义。

（三）器材与试剂

1.抗原　HIV抗原。

2.试剂　包被液（50 mmol/L碳酸钠，pH9.6；20 mmol/L Tris-HCL，pH8.5）、洗涤液（PBS-吐温-20：每升PBS加1 mL吐温-20）、封闭液（含1%BSA的PBS或脱脂牛奶）、0.1 mol/L醋酸钠的TMB溶液（加30%过氧化氢溶液使醋酸终浓度为0.01%），第二抗体等。

3.材料　10～100 μL加样枪、枪头、高吸附平底96孔培养板、离心管、酶标仪等。

（四）步骤与方法

1.抗原包被　用包被液稀释抗原（浓度范围为0.2～10 μg/mL），每孔加100 μL至高吸附平底96孔培养板，用封口膜将培养板密封以防止挥发，置于4℃冰箱孵育过夜或置于室温孵育2 h（也可以在37℃孵育1 h）。第二天，弃去包被液并用蒸馏水或去离子水洗两遍。

2.封闭　每孔加入50～200 μL封闭液，37℃或室温孵育1 h，孵育时用保鲜膜包好或置于湿盒中。

3.加受检抗体　弃去封闭液，加100 μL患者血清样本至每孔，37℃孵育1 h。样本的推荐稀释度为1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，以及不稀释。吸去含被检样本的溶液，用洗涤液或蒸馏水清洗10遍。用封闭液将第二抗体稀释至推荐浓度，每孔加入100 μL，密封，在室温或37℃摇晃孵育1 h，洗涤。

4.底物显色　每孔加100 μL TBM溶液，室温反应30 min。如有需要，当颜色深度达到要求后，加入50 μL10%的磷酸溶液终止反应，在酶标仪上检测相应波长的吸光度。

（五）注意事项与小结

（1）试剂使用前轻摇混匀。浓缩液出现结晶时，置于37℃溶解。不同批号或不同厂家的试剂不可混用。

（2）所有标本、废弃物、对照等均按传染性污染物处理。

（3）结果判定必须在15 min内完成。

（1）ELISA的基本步骤有哪些？

（2）ELISA的注意事项有哪些？

三、病毒的核酸检测（PCR法检测HPV DNA）

（一）临床意义

利用分子生物学方法检测血液中是否存在病毒核酸，从而诊断有无相应病毒感染是目前病毒性疾病快速诊断的主要方法，主要包括PCR、核酸杂交等。本实验通过PCR法检测患者宫颈脱落细胞标本中HPV DNA，为临床尖锐湿疣、宫颈癌等疾病的诊断和治疗提供参考。

（二）目的要求

掌握PCR法检测HPV DNA的分子生物学原理及应用方法。

（三）器材与试剂

1.标本　临床标本及对照HBV待检血清、阳性对照血清或者阳性模板等。

2.PCR反应试剂　细胞裂解液即50 mmol/L pH7.4 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L EDTA、5 μg/mL Aprotinin、5 μg/mL Leupeptin、1%Triton X-100、1%Sodium deoxycholate dNTPs，Taq DNA聚合酶，HPV阳性模板10ng/mL等。

3.引物　HPV上游引物5'-CGTCCAAGAGGAAACTGATC-3'和下游引物5'-GCACAGGGACATAATAATGG-3'各12.5 pmol/L，能检测包括HPV6、11、16、18型等在内的多型HPV病毒。

4.电泳用试剂　琼脂糖、溴化乙啶、DNA Marker、电泳缓冲液（TAE pH 7.8）等。

5.仪器　PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪等。

6.其他　Eppendorf管、PCR反应管、微量加样枪等。

（四）步骤与方法

1.标本处理　取患者宫颈脱落细胞标本，经1500 r/min离心10 min后，弃去上清液，加入100 μL细胞裂解液混匀。经55℃水浴50 min及100℃沸水浴10 min，继续以10000 r/min离心5 min后取上清液作为标本DNA模板。

2.核酸扩增　取PCR反应管加入提取好的标本DNA模板2 μL（或直接加2 μL阳性模板做阳性对照），加入HPV上游引物、下游引物、dNTPs，无菌去离子水加至50 μL后放入95℃水浴10 min，取出后5000 r/min离心数秒，加入Taq DNA聚合酶3 U/μL和50 μL无菌液体石蜡按下列条件扩增：93℃3 min，预变性，然后按93℃变性反应1 min、55℃退火反应45 s、72℃延伸反应1.5 min，共做35个循环，最后置于72℃保温5 min。

3.电泳检测　直接从PCR扩增后的反应管中取10 μL下层液体加样，经2%的琼脂糖凝胶电泳30 min（5 V/cm）后于凝胶成像仪上观察。若在阳性模板对照处出现橙黄色条带，则为HPV阳性。

（五）注意事项与小结

（1）DNA提取物使用前需充分融化后混匀。

（2）反应液表面要加封盖剂，防止反应液蒸发。

（3）反应管加入标本DNA模板后要充分混匀。

（4）电泳点样时，枪头切勿损坏样本槽，否则影响条带形成。