第一节　病毒的分离培养及鉴定

一、鸡胚培养

（一）临床意义

鸡胚培养是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法。此方法可用于进行多种病毒的分离、培养鉴定、中和实验、抗原制备以及疫苗的生产等。鸡胚的敏感范围很广，且一般无病毒隐性感染，多种病毒均能适应，因此，鸡胚培养是常用的一种培养动物病毒的方法。

（二）目的要求

熟悉病毒鸡胚培养的基本操作方法。

（三）器材与试剂

1.毒种　牛痘病毒液、流感病毒液、乙型脑炎病毒液等。

2.鸡胚　白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）等。

3.材料　孵箱、检卵灯、砂轮、蛋座木架、1 mL注射器、无菌生理盐水、2.5%碘酒、70%乙醇、无菌手术刀、镊子、剪刀、橡皮乳头、封蜡（固体石蜡加1/4凡士林，溶化）、无菌培养皿、灭菌盖玻片等。

（四）步骤与方法

1.准备鸡胚　选择健康来亨鸡的受精卵，将受精卵置于相对湿度40%～70%的38～39℃孵箱孵育3天，每天翻动鸡胚1次。第4天起，用检卵灯观察鸡胚发育情况。活受精卵可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，随着转动鸡胚可见胚影活动。未受精卵只见模糊的卵黄阴影，不见鸡胚的形迹。若出现胚动呆滞或胚影固定于卵壳或血管暗淡模糊者，说明鸡胚生长不良，应随时淘汰。选择生长良好的鸡胚一直孵育到接种前，需依据所培养的病毒种类和接种途径来选取适当胚龄的受精卵。

2.接种方法

1）绒毛尿囊膜接种法

（1）将孵育10～12天的鸡胚放在检卵灯上，用笔画出胚胎近气室端绒毛尿囊膜发育良好的地方。

（2）用碘酒消毒标记的记号处，并用砂轮在该处的卵壳上磨开一三角形（每边约6 mm）的小窗，切忌弄破下面的壳膜。同时用无菌刀尖在气室顶端钻一个小孔。

（3）用镊子揭去所开小窗处的卵壳，露出下面的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心划破壳膜，切勿损伤下面的绒毛尿囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛尿囊膜，以利于两膜分离。

（4）用针尖刺破气窗小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。

（5）用注射器通过壳膜窗孔滴0.05～0.1 mL牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。

（6）在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，使之成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将胚始终保持在人工气室上方的位置进行培养，温度为37℃，观察48～96 h后收获。

（7）若接种成功，可收获病毒。首先将待收获的鸡胚人工气室处消毒，用无菌镊子扩大卵窗，除去卵壳及壳膜，轻轻夹起绒毛尿囊膜，沿人工气室周围将接种的绒毛尿囊膜全部剪下，置于无菌平皿内，用无菌生理盐水洗涤1～2次，观察病毒，可在绒毛尿囊膜上见到痘斑。低温保存备用。

2）尿囊腔接种法

（1）将孵育10～12天的鸡胚在检卵灯上观察，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方，大约距气室底边0.5 cm处做记号。

（2）将鸡胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用无菌刀尖在记号处钻1个小孔。

（3）用带18 mm长针头的1 mL注射器吸取流感病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0.1～0.2 mL病毒液。

（4）用石蜡封孔后置于35℃孵箱内孵育48～72 h，每天检视鸡胚。

（5）72 h后取出，放于4℃冰箱内过夜，目的是冻死鸡胚并使血液凝固，避免收获时血细胞凝集病毒而降低病毒滴度。

（6）次日取出鸡胚，消毒气室部位的卵壳，用无菌剪刀沿气室线上缘剪去卵壳，用无菌镊子撕去卵膜。再用无菌毛细管吸取尿囊液，收集于无菌试管内。注意避开血管且不要刺破卵黄囊，每只鸡胚可收获尿液5～6 mL，利用血凝实验检测有无病毒。

3）羊膜腔接种法

（1）将孵育10～12天的鸡胚在检卵灯上观察，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在胚胎最靠近卵壳的地方做记号。

（2）用碘酒消毒气室部位的蛋壳，并用砂轮在记号处的卵壳上磨开一三角形（每边约6 mm）的小窗，切忌弄破下面的壳膜。

（3）用无菌镊子揭去蛋壳和壳膜，滴加无菌液体石蜡1滴于下层壳膜上，使其透明以便视察。

（4）用灭菌尖头镊子，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，并夹住羊膜将其提出绒毛尿囊膜之外。

（5）将带有针头的注射器刺入羊膜腔内，注入流感病毒液0.1～0.2 mL。最好用无斜削尖端的钝头，以免刺伤胚胎。同时用镊子将羊膜轻轻送回原位。

（6）用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住，置于35℃孵箱内孵育36～48 h，保持鸡胚的钝端朝上。

（7）收获时，先消毒气室部，剪去壳膜及绒毛尿囊膜，吸弃尿囊液，夹起羊膜，用细头毛细管刺入羊膜腔内吸取羊水，收集于无菌小瓶内冷藏备用。每只鸡胚可收获羊水0.5～1 mL。

4）卵黄囊接种法

（1）取5～8天的鸡胚，在检卵灯下标记气室及胚胎位置，垂直放于蛋架上，气室端向上。

（2）用碘酒、乙醇消毒鸡胚顶部气室中央，用无菌刀尖打1个小孔，不损伤壳膜。

（3）将1 mL注射器换上12号长针头，吸取乙型脑炎病毒液，迅速稳定自小孔刺入。对准胚胎对侧，垂直接种于卵黄囊内（约30 mm），注入病毒液0.2～0.5 mL，退出注射器。

（4）用蜡封口，置于35℃孵箱内孵育，每天检视并翻动2次。

（5）取孵育24 h以上濒死的鸡胚，无菌操作用镊子除去气室卵壳，撕去绒毛尿囊膜和羊膜，夹起鸡胚，切断卵黄囊，将卵黄囊和绒毛尿囊膜分开，用无菌生理盐水冲去卵黄，留取卵黄囊。

（五）注意事项

（1）接种鸡胚所用器械和物品均需无菌，严格遵守无菌操作程序。

（2）注射器抽取病毒液后排除气体时，针头处放一个无菌干棉球，以防止病毒液溅出。

（3）在接种后24 h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，应弃去不用。

（4）鸡胚具有广泛易感性，收获物中富含大量病毒，结果易于判断，条件易于控制。

（5）鸡胚来源方便，价格低廉，操作简便，适用于病毒分离和大量抗原的制备。

（六）思考题

（1）鸡胚培养的基本步骤有哪些？

（2）鸡胚培养的注意事项有哪些？

二、动物培养

（一）临床意义

动物实验是最早用于病毒培养的实验技术，可用于病毒的分离鉴定，还可用于抗病毒血清的制备、致病性和抗病毒药物研究等实验。根据不同的实验目的、实验动物种类和接种材料，采用不同的接种途径。常用的接种途径有皮下接种、皮内接种、静脉接种、腹腔接种，颅内接种、鼻腔接种等。

（二）目的要求

（1）熟悉小白鼠颅内接种病毒的方法。

（2）熟悉小白鼠鼻腔接种病毒的方法。

（三）器材与试剂

（1）毒种：乙型脑炎病毒液、鼠肺适应株流感病毒液等。

（2）其他：小白鼠（3周龄）、1 mL注射器、无菌毛细管等。

（四）步骤与方法

1.小白鼠颅内接种

（1）用左手将小白鼠的头部和体部进行固定。

（2）将小白鼠头部右侧眼和耳之间的部位用碘酒、乙醇消毒。

（3）用带有26号针头的1 mL注射器抽取乙型脑炎病毒液，在小白鼠眼后角与耳前缘及颅中线构成的三角形中心，刺入颅腔（其深度为针头的1/3），注射0.01～0.02 mL病毒液。注射完毕，将用过之物一并煮沸。

（4）接种后每天观察数次，一般在3～4天后发病，小白鼠食欲减退，活动迟钝、耸毛、震颤、卷曲，尾强直，逐渐麻痹、瘫痪甚至死亡。取小白鼠脑组织、制备匀浆上清液，可进一步传代并进行病毒鉴定。

2.小白鼠鼻腔接种

（1）接种前先用蘸有乙醚的棉球放于小白鼠鼻处，通过吸入麻醉小白鼠。

（2）用无菌毛细管吸取少许鼠肺适应株流感病毒液，将麻醉后的小白鼠鼻孔向上，直接滴入流感病毒液，使液滴随动物呼吸进入鼻腔，一般滴入0.03～0.05 mL，不宜过多。

（3）继续将小白鼠放入笼中喂养，逐日观察。

（4）小白鼠一般数日后发病，出现咳嗽、呼吸加快，最后死亡。剖检肺部可发现感染性病灶，取呼吸道洗液可获病毒。

（五）注意事项与小结

（1）动物实验室必须达到相应的级别，具备严格的消毒条件。操作人员应注意安全。

（2）操作要细致，防止小白鼠死亡。

（3）实验所用物品及实验动物，用后需彻底消毒，以确保不污染环境。

（六）思考题

小白鼠鼻腔接种法和颅内接种法可应用于哪些病毒？

三、组织细胞培养

（一）临床意义

细胞培养是病毒分离检测的常规手段，从培养细胞中分离病毒的方法被认为是病毒检测和诊断的金标准，可分为原代培养和传代培养两种。常用于病毒的分离鉴定、疫苗的制备及抗病毒药物筛选等研究。病毒对宿主细胞常见的损害包括致细胞病变效应（CPE），使细胞变圆，细胞质地发生改变（颗粒状或透明玻璃质），以及发生细胞融合、病毒包涵体形成、细胞空泡形成等，甚至死亡、溶解等情况。

（二）目的要求

（1）掌握细胞原代培养的基本方法，观察细胞感染后出现的CPE。

（2）掌握细胞传代培养的基本方法。

（三）器材与试剂

1.毒种　水疱性口炎病毒液。

2.培养基　细胞生长培养基（含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素、链霉素双抗的RPMI 1640液），维持培养基（无血清或含2%胎牛血清的RPMI1640液），血清需经56℃30 min灭活，以消除对病毒的干扰。

3.宿主细胞　9～11天鸡胚，Hela细胞等。

4.试剂　0.25%胰蛋白酶、Hanks液、75%乙醇、双抗（青霉素和链霉素）、PBS，Bouin's固定液、姬姆萨缓冲液、姬姆萨染液、二甲苯、丙酮、丙酮∶二甲苯（2∶1）、丙酮∶二甲苯（1∶2）、中性树胶等。

5.其他　培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、三角烧瓶、平皿、吸管、试管、无菌眼科剪、废液缸、血细胞计数板、蜡盘、手术器械、10～100 μL加样枪、生物安全柜（超净台）、二氧化碳培养箱、倒置显微镜等。

（四）步骤与方法

1.原代培养

（1）取胚：以75%乙醇消毒鸡胚气室部分，除去卵壳，用无菌镊子将鸡胚取出，放置于无菌平皿中，用Hanks液洗涤3次。

（2）分离组织：用手术器械分离外膜和结缔组织后，用弯头剪将胚胎尽量剪碎，使每个组织块小于1 mm3。在操作时应尽量将平皿盖半盖住平皿以防空气中尘埃落下污染组织。再用含有双抗的Hanks液洗涤2次后自然沉淀，用吸管吸去上清液。

（3）消化：加入0.25%胰酶溶液进行消化，置于37℃水浴箱消化15～30 min，吸弃胰酶溶液，用冷的Hanks液轻洗1～3次，以去除残存的胰酶。

（4）分散细胞及计数：加入10 mL不含血清的培养液，反复吹打细胞悬液使其充分分散，再将细胞悬液通过不锈钢筛网进行收集并用血细胞计数板进行计数。

（5）细胞分装培养：以3×104个/毫升的细胞浓度接种分装于培养瓶内，培养基为细胞生长培养基。轻轻地前、后、左、右摇晃使细胞分布均匀。将培养瓶置于二氧化碳培养箱培养过夜，第二天在倒置显微镜下观察细胞是否长出单层，分布是否均匀并达到80%以上的融合度。

（6）病毒的接种：选择2瓶已长成单层的细胞，吸去培养液，用Hanks液洗涤2次，其中1瓶加入100 μL病毒液和0.5 mL维持培养基，摇匀，置于二氧化碳培养箱37℃吸附30 min，然后吸弃病毒接种液，加新鲜维持培养基；另1瓶不接种，直接加入新鲜维持培养基后，作为空白对照。将2瓶细胞置于二氧化碳培养箱37℃培养24 h，追踪观察CPE发生情况。

（7）姬姆萨染色：一旦观察到CPE，轻轻地用PBS先将细胞洗3次，每次5 min，继而加入Bouin's固定液固定10 min后，用姬姆萨缓冲液洗3次，然后加入姬姆萨染液染色1 h，再用姬姆萨缓冲液清洗后依次用丙酮处理15 s，2∶1的丙酮-二甲苯处理30s，1∶2的丙酮-二甲苯处理30 s，最后用二甲苯处理10 min，紧接着用中性树胶封片。显微镜下观察CPE、包涵体、细胞融合及病毒空泡形成情况。

（8）病变程度用“+”表示：

-：无细胞变化。

+：1/4的细胞出现病变。

++：1/4～1/2的细胞病变。

+++：1/2～3/4的细胞病变。

++++：3/4～全部的细胞病变。

2.传代培养

1）传代

（1）选择细胞覆盖率达到80%～90%的单层Hela细胞1瓶，先将原有培养基吸弃，再用Hanks液洗涤2次。

（2）加适当的0.25%胰蛋白酶溶液，使其覆盖细胞单层，消化1～2 min。

（3）在显微镜下观察到细胞固缩、变圆，细胞间出现间隙时终止消化。

（4）吸弃消化液，加入等体积的细胞生长培养基，用吸管吹打细胞，使细胞脱落、悬浮成为单个细胞。

（5）按原来体积2～4倍的比例稀释后分瓶培养，一般2～3天即可长成单层。

2）冻存

（1）把细胞消化下来并离心（同上）。

（2）用配好的冻存液将细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静置几分钟，写明细胞种类，冻存日期。

（3）依次置于4℃30 min，-20℃30 min，-80℃过夜，然后放到液氮罐中保存。

3）复苏

（1）把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。融化后（大概1～1.5 min），拿出来喷乙醇后放到超净工作台里。

（2）把上述细胞悬液吸到装10 mL培养基的15 mL的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把黏在壁上的细胞都洗下来），1000 r/min离心5 min。

（3）弃上清液，加1 mL培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10 mL培养基的10 cm培养皿中，前、后、左、右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

（4）标好细胞种类、日期、培养人名字等，放到二氧化碳培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

（5）每3天换一次培养基。

（五）注意事项与小结

（1）严格进行动物皮肤消毒，使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酒消毒，成年动物先用3%～5%碘酒消毒，后用75%乙醇消毒。

（2）严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。

（3）吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；吸取液体时，避免瓶口和吸管碰撞。

（4）离心管入台前，管口、管壁应消毒。

（5）实验者离开超净台时，要随时用肘部关闭工作窗。

（6）使用过的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一个器皿中继续消毒，在浸泡器械时剪刀口要叉开放，镊子弯头要向下放，并加盖消毒。

（六）思考题

（1）细胞培养法可应用于哪些病毒的检测？

（2）如何避免细胞培养过程中受到污染？

四、病毒定量的常用方法

1.血凝实验

1）原理　血凝实验是对病毒颗粒进行间接定量的最常用的方法，检测样本通常为细胞培养上清液或从鸡蛋中收集的鸡胚尿囊液。本实验是利用有些病毒蛋白（如流感病毒的凝集素）具有结合并凝集红细胞（RBC）的特性。

2）步骤与方法

（1）制备病毒稀释液，每孔加50 μL PBS至圆底96孔培养板。

（2）加50 μL病毒液至第一孔，混合均匀后，吸50 μL至第2孔，混匀，依次倍比稀释，最后一孔吸50 μL，弃至漂白水中。

（3）依次向各孔加入0.5%火鸡红细胞悬液50 μL，轻轻混匀，室温下静置30～60 min后观察结果。

3）结果　阴性结果即不凝集者（-），红细胞呈点状沉于孔底，若红细胞发生凝集，红细胞会均匀平铺于整个孔底，则为阳性。以出现50%凝集阳性的最高稀释度为病毒的血凝滴度。

2.病毒空斑实验

1）原理　病毒空斑实验是使用最广泛的病毒滴度检测方法之一。一个蚀斑通常是由最初感染培养的宿主细胞单层的一个病毒颗粒形成的。在细胞单层上覆盖一层半固体培养基（最常用的是琼脂糖），以防病毒从一开始的宿主细胞扩散至附近未感染的细胞。这样，每个病毒颗粒会在单层细胞上造成一个由未感染细胞围绕的小圆斑，称为空斑，当空斑长到足够大时，可在显微镜下观察甚至直接肉眼可见。计数不同稀释度下的空斑形成数量可以知道每毫升病毒颗粒数或每毫升空斑形成单位（PFU）。由于每个空斑来自起初的1个病毒颗粒，这样可以从单个空斑中纯化得到来源于单个克隆的病毒种群。但很多时候，为了更清楚地辨别空斑，需要对细胞用MTT或中性红等染料进行染色以增加细胞与空斑间的对比度。

2）步骤与方法

（1）细胞接种：每孔按1×106个细胞/毫升培养基接种细胞至6孔培养板内。轻轻地前、后、左、右摇晃培养板使细胞分布均匀。将细胞置于培养箱生长过夜。第二天，显微镜下观察细胞，确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。

（2）制备琼脂糖：用蒸馏水配制2%的琼脂糖，高压蒸汽灭菌并使之溶化，然后将琼脂糖置于42℃水浴中使之保持在溶解状态。同时将细胞培养基预热至37℃。

（3）准备病毒梯度稀释液：标记6个无菌离心管，用于制备病毒稀释液。在第1管内加入990 μL细胞生长培养基，剩下5管分别加入900 μL细胞生长培养基。按以下方法进行梯度稀释：在第1管中加入10 μL病毒原液（稀释度1∶100）充分混匀，然后从第1管吸100 μL加入第2管，依次类推，进行10倍梯度稀释。第2管至第6管的稀释度分别为10-3到10-7。

（4）感染细胞单层：用无菌吸管吸去6孔培养板中的培养液，每孔加入100 μL上述稀释好的10-3到10-7的病毒液，留一个孔不加病毒液作为空白对照。每板按同样的方法操作。室温放置1h让病毒进入宿主细胞。

（5）覆盖琼脂糖：1 h后，小心吸去病毒液，避免碰到细胞。将2%的琼脂糖和预热的培养基按1∶1的比例混匀后轻轻地加1.5 mL至每孔细胞上，室温静置20 min使其冷却凝固成覆盖层。将培养板置于室温或37℃培养6～10天。

3）结果　空斑观察和计数：用光从45°角照射培养板，或者将培养板倒置于一个黑色背景上，计数空斑数量。为了更易于观察，也可以每孔加入1 mL 0.03%的中性红（用水或PBS稀释），室温或37℃孵育2～3 h，未被病毒感染的细胞会被中性红染上而中间未被着色的小区域即为空斑（直径为0.5～3 mm）。计数每孔的空斑数量并按以下方法计算病毒滴度：病毒滴度（PFU/mL）=空斑数×（1 mL/0.1 mL）/稀释倍数。

3.半数组织培养感染剂量TCID50测定

1）原理　TCID50（tissue culture infective dose）即半数组织培养感染剂量，又称50%组织细胞感染量，是指能在半数细胞培养板孔或试管内引起CPE的病毒量。病毒的毒价通常以每毫升或每毫克含多少TCID50表示。

2）步骤与方法

（1）宿主细胞接种：每孔按1×104个/毫升细胞浓度接种细胞至48孔培养板内，轻轻地前、后、左、右摇晃培养板使细胞分布均匀。将细胞置于培养箱生长过夜。第二天在显微镜下观察细胞，确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。

（2）制备病毒梯度稀释液：在病毒感染当天，将病毒原液用细胞生长培养基按以下方法做1∶10梯度稀释。每个病毒样本标记24个无菌离心管，按6（行）×4（列）排好，每列有6管。在第一行的4个管内加入990 μL细胞生长培养基，剩下5行每管加900 μL细胞生长培养基。将病毒原液加10 μL至第1行的每个管中作1∶100稀释。然后从第一行每管中吸取100 μL加入第2行相对应的管中，依次类推，进行10倍梯度稀释。每列第2管至第6管的稀释度分别为10-3到10-7。

（3）感染细胞单层：在48孔培养板的盖子上做好标记，每个条件有4个复孔，上方写上病毒名称，侧面标上每行相应的病毒稀释度，每板要有4孔不加病毒的阴性对照。小心吸去每孔内的培养基至剩0.1 mL，轻轻加入0.1 mL不同稀释度的病毒液至每孔内，每个稀释度感染4个复孔，按稀释度从高到低顺序加，即从48孔培养板的下面往上加。在37℃孵育2 h使病毒充分接触细胞，然后在每孔中加入0.5 mL维持培养基，并将细胞置于37℃二氧化碳培养箱内培养1～4周，其间监测CPE的形成情况。

3）结果　观察并计算TCID50值：在倒置显微镜下观察各稀释度的CPE发生情况。用一系列梯度稀释的病毒样本感染培养的细胞单层，每个稀释度感染4孔细胞（4个复孔）。培养一定的时间后，观察CPE，其中观察到CPE的孔标记为阳性（+）。如某稀释度的4个孔中，有一半的孔（2孔）为CPE阳性，其余一半（2孔）为阴性，则该稀释度即为终点（50%的平行培养的细胞复孔被病毒感染的稀释度）。根据该结果可计算每毫升50%感染剂量（即TCID50）。