五、综合性实验

（一）目的要求

熟悉临床标本中常见真菌的检查方法。

（二）器材与试剂

1.临床标本　体表真菌的标本可取毛发、皮屑、甲屑、痂等；深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。

2.培养基　沙保弱培养基、玉米粉吐温-80琼脂、CHROMagar念珠菌显色平板、血琼脂平板，各种糖发酵及同化实验培养基、尿素琼脂培养基等。

3.试剂　10%KOH溶液、生理盐水、乳酸酚棉蓝染液、革兰染液、优质墨汁等。

4.其他　盖玻片、载玻片、镊子、滴管、小试管、培养箱、普通光学显微镜等。

（三）步骤与方法

1.采集标本　无菌操作采集标本。体表真菌的标本在分离前先用75%乙醇消毒。

2.培养检查　标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上，置于室温或37℃培养1～3周。必要时可进行小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断。

3.菌种鉴定

（1）丝状真菌：包括皮肤癣菌和霉菌，主要是形态学的鉴定，如直接涂片观察、小培养显微镜鉴定。根据菌落形成所需要的时间，在不同条件下生长的情况，菌落表面及背面的形态、色素，培养基中有无色素，培养物用乳酸酚棉蓝染色后镜检找特征性标志结构等。

（2）酵母菌：分为形态学鉴定及生化实验。形态学鉴定主要是玉米粉吐温-80诱导下特征菌丝及特征孢子的检验，血清芽管形成，而在形态学基础上还必须进行生化鉴定。对于酵母样真菌首选CHROMagar念珠菌显色平板，而显色平板不能鉴定的酵母样真菌可采用自动仪器YBC卡或API板进行鉴定；而同化实验推荐平皿法，一个平皿内可观察多种糖类的同化情况，且结果易于观察，重复性好。

4.结果记录及分析　记录并报告待检菌的结果。

（四）注意事项

1.培养基的选择　一般培养真菌同时选用两种培养基，一种为沙保弱培养基中加抗菌剂，常为氯霉素和放线菌酮；另一种是沙保弱培养基中仅加氯霉素，不加放线菌酮。如果单用一种培养基，则容易忽略其他种类的真菌诊断。

2.培养时间　各种真菌的生长速度不同，所以报告的时间也不同。一般皮肤癣菌生长较缓慢，在26～28℃的环境下需要培养2～4周才能发报告，但是，皮肤癣菌涵盖的菌种较多，也需要区别对待；酵母菌生长较快，通常2～3天就可以发报告，如果为阴性则需要观察1周；霉菌生长也比较快，一般2～4天就可以发报告。

3.确证　对于双相型真菌，采用小培养法培养后，还须经过脑心浸液培养基转相实验后确证。

（五）思考题

（1）引起深部感染的真菌有哪些？临床上如何进行鉴定？

（2）怎样进行浅部真菌的临床标本检查？

（3）简述双相真菌的特点。

（张欠欠）