二、假丝酵母菌属

（一）临床意义

假丝酵母菌俗称念珠菌，对人致病的有11种，其中以白假丝酵母菌为最常见、致病力最强的条件致病性真菌，可引起人类皮肤、黏膜和内脏的假丝酵母菌病。此外，热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌也为常见致病菌。

（二）假丝酵母菌属的检验程序

假丝酵母菌属的检验程序见图15-4。

图15-4　假丝酵母菌属的检验程序

（三）目的要求

（1）掌握常见致病性假丝酵母菌的培养特性和鉴定实验。

（2）熟悉白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌等在科玛嘉（CHROMagar）念珠菌显色平板上的鉴定要点。

（四）器材与试剂

1.菌种　白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌等。

2.培养基　沙保弱培养基、血琼脂平板、玉米粉吐温-80琼脂平板、糖发酵及同化实验培养基、CHROMagar念珠菌显色平板等。

3.试剂　革兰染液、美蓝染液、小牛血清等。

4.其他　盖玻片、载玻片、小试管、培养箱等。

（五）步骤与方法

1.形态观察　无菌操作挑取白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌的培养物制片，革兰染色，镜下观察其芽生孢子、是否有假菌丝以及染色性。

2.分离培养　无菌操作挑取上述三种菌，分别接种于沙保弱培养基和血琼脂平板上，37℃培养1～4天后观察其菌落特征。

3.鉴定实验

（1）芽管形成实验（试管法）：取无菌小试管三支，加入0.2 mL小牛血清，分别接种白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌，充分振荡混匀数分钟后，置于37℃培养箱孵育，每隔1 h用接种环取出试管内的含菌血清置于载玻片上，加上盖玻片镜检观察有无芽管形成，共检查3～4次。

（2）厚膜孢子形成实验：将上述三种菌分别接种于玉米粉吐温-80琼脂平板上，25℃孵育1～3天后，将菌落连同周围培养基割下一小块置于载玻片上，再以盖玻片压平，美蓝染色，镜下观察是否有厚膜孢子。

（3）糖同化及发酵实验：无菌操作挑取白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌培养物，分别接种葡萄糖、麦芽糖、蔗糖发酵管，37℃培养1～2天，观察结果；并同时做这三种糖的同化实验（具体方法参照实验十四）。

（4）CHROMagar念珠菌显色平板鉴定：无菌操作挑取上述三种菌，分别分区划线接种于CHROMagar念珠菌显色平板上，37℃培养1～2天后观察菌落颜色和质地。

图15-5　白假丝酵母菌菌落形态

4.结果

（1）菌体镜下形态和菌落特征：镜下可见上述三种菌细胞均为革兰阳性、圆形或卵圆形菌体或芽生孢子，白假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌镜下可见假菌丝。热带假丝酵母菌不形成假菌丝。三种假丝酵母菌菌落均为类酵母型，表面光滑湿润，边缘整齐，灰白色或奶酪色。白假丝酵母菌菌落形态见图15-5。

（2）芽管形成实验：白假丝酵母菌在37℃孵育2～3 h可由孢子长出芽管，热带假丝酵母菌在此条件下一般不形成芽管，但在37℃孵育超过6 h也可形成芽管。白假丝酵母菌血清芽管实验见图15-6。

（3）厚膜孢子形成实验：白假丝酵母菌在菌丝顶端、侧缘或中间形成大量壁厚、圆形的厚膜孢子，其他两种真菌都不产生厚膜孢子。白假丝酵母菌纯培养的镜下形态见图15-7。

图15-　7白假丝酵母菌纯培养的镜下形态（美蓝染色）

图15-6　白假丝酵母菌血清芽管实验

（4）假丝酵母菌属的糖同化及发酵实验结果见表15-1。

表15-1　假丝酵母菌属的糖同化及发酵实验

注：+表示比阴性对照长得好；-表示长得不如对照或不发酵；⊕表示发酵产气。

（5）CHROMagar念珠菌显色平板鉴定结果：白假丝酵母菌菌落呈蓝绿色，热带假丝酵母菌菌落呈蓝灰色，克柔假丝酵母菌菌落呈淡粉紫色。CHROMagar念珠菌显色平板鉴定念珠菌见图15-8。

图15-　8CHROMagar念珠菌显色平板鉴定念珠菌

（六）注意事项与小结

（1）要注意芽管形成实验孵育时间不能超过3 h，因3 h后可生成假菌丝。

（2）芽管形成实验所用菌种应来自沙保弱培养基，菌龄为24～48 h，接种菌量约为106 CFU/mL。

（3）做厚膜孢子形成实验鉴定白假丝酵母菌，孵育温度以25℃最佳，因其在30℃以上不产生厚膜孢子，此点是与都柏林假丝酵母菌的重要鉴别点。

（4）绝大多数假丝酵母菌在CHROMagar念珠菌显色平板上，37℃培养1天便可得到准确鉴定，但热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌在该平板上培养时间应延长至2天后，颜色反应方才明显。

（七）思考题

（1）通过直接镜检如何辨别常见的致病性假丝酵母菌？

（2）假丝酵母菌的假菌丝与霉菌的菌丝有何不同？