三、真菌药物敏感性检测

（一）目的要求

（1）掌握真菌药敏实验的原理、操作方法和结果判读。

（2）熟悉稀释法的质控。

（二）器材与试剂

1.菌种　假丝酵母菌等。

2.培养基　沙保弱培养基、RPMI 1640等。

3.抗菌药物　两性霉素B、酮康唑、5-FC、氟康唑等。

4.其他　无菌生理盐水、蒸馏水、丙磺酸吗啉缓冲液（MOPS）、二甲基亚砜、96孔培养板、分光光度计、0.5麦氏标准比浊管、微量加样枪、接种环、培养皿、试管等。

（三）实验原理

将抗真菌药物进行倍比系列稀释，然后接种定量待检菌，经孵育后观察结果，从而测定抗真菌药物抑制该菌的MIC。

（四）步骤与方法

1.药物原液的配制　药物原液浓度10倍于最高实验浓度，5-FC、氟康唑用蒸馏水配制；多烯类药物用二甲基亚砜配制。

2.接种菌液的制备　将待检菌接种于沙保弱培养基，35℃培养24 h，至少传代两次，以保证纯种，挑取5个直径1 mm菌落置于5 mL无菌生理盐水中混匀15 s，用分光光度计在530 nm波长下校正浊度为0.5麦氏比浊标准，相当于（1～5）×106 CFU/mL，再以RPMI 1640稀释成1∶2000，（0.5～2.5）×103CFU/mL。

3.药液稀释

（1）非水溶性抗真菌药物：两性霉素B、酮康唑用二甲基亚砜倍比稀释，浓度范围从原液浓度至实验终浓度的100倍，然后再以RPMI 1640做10倍稀释（即160～0.3 μg/mL）作为实验时用量。

（2）水溶性抗真菌药物：5-FC、氟康唑直接以RPMI 1640做倍比稀释，浓度范围为原液至10倍于实验终浓度（640～1.2 μg/mL）。

4.常量稀释法　取上述系列稀释的药液0.1 mL，于带螺帽的试管中，各管均再加入0.9 mL含菌培养液，使最终药物浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03 μg/mL（两性霉素B、酮康唑）或是64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.12 μg/mL（5-FC、氟康唑）。细菌生长对照管为0.9 mL含菌培养液+0.1 mL无药培养液，同时无菌、无药的培养基做阴性对照。35℃培养48 h后观察结果。

5.微量稀释法　将4种制备好的实验用药用RPMI 1640稀释成32～0.06 μg/mL（两性霉素B、酮康唑）和128～0.24 μg/mL（5-FC、氟康唑）。于96孔培养板中加入0.1 mL，之后再加入0.1mL1∶1000稀释的菌液（（1～5）×103 CFU/mL），同4所述，设置对照。35℃孵育后观察结果。

6.结果判读　观察各管（孔）生长情况。

（1）常量稀释法判读标准：两性霉素B，MIC定义为抑制测试菌肉眼可见生长的最低药物浓度；5-FC和吡咯类，MIC定义为与生长对照相比80%生长被抑制的最低抑菌浓度。

（2）微量稀释法判读标准：两性霉素B，MIC定义为完全抑制生长（微孔内完全透明）的最低药物浓度；5-FC和唑类药物，MIC定义为与生长对照相比50%生长被抑制的最低药物浓度。

7.质控　采用标准菌株作为每次测定质控菌株，其MIC应落在预期值范围内（表14-1）。

表14-1　常量稀释法质控菌株MIC预期值范围　（单位：μg/mL）

（五）注意事项

（1）药物原液配制：抗真菌药物来自制药厂，不能使用临床制剂。配制时实际称量须根据各种药物生物活性加以校正。配制药物的原液应小量分装于无菌聚丙烯管，置于-60℃储存，开启后需当日使用。

（2）培养基的pH、离子浓度、孵育温度和时间对实验结果有影响；临床检验中常用标准菌株来进行质控，当标准菌株的结果在可接受的范围内，指定临床菌株的结果可靠。

（3）结果判读标准的选择要考虑药物本身的特性，尤其在比较不同来源的抗真菌药敏实验结果时，更需要注意比较终点判读的标准是否相同，是50%或者80%还是100%生长受抑制。

（4）常量肉汤稀释法不宜处理大批量标本。

（六）思考题

稀释法的原理是什么？检测的真菌主要包括哪些？

（张欠欠）