二、真菌的形态学检查和生化鉴定

（一）目的要求

（1）掌握常用真菌染色技术中的乳酸酚棉蓝染色法、革兰染色法和墨汁负染色法。

（2）掌握临床常见病原性真菌的常规鉴定方法。

（3）熟悉不染色标本直接检查的制片技术。

（二）器材与试剂

1.菌种　浅部感染真菌（红色毛癣菌、石膏样小孢子菌）和深部感染真菌（白假丝酵母菌、新生隐球菌）的沙保弱培养基培养物等。

2.标本　患者的甲屑、皮屑、毛发，新生隐球菌性脑膜炎患者的脑脊液等。

3.培养基　沙保弱培养基、毛发穿孔液体培养基、各种糖发酵及糖同化实验培养基等。

4.试剂　乳酸酚棉蓝染液、优质墨汁、100 g/L KOH溶液、革兰染液、生理盐水等。

5.其他　盖玻片、载玻片、镊子、无菌试管、普通光学显微镜等。

（三）步骤与方法

1.形态学鉴定

1）不染色标本镜检　用镊子取甲屑、皮屑少许或病发一根，置于载玻片上，滴加100 g/L KOH溶液1～2滴。稍待片刻，盖上盖玻片，将载玻片置于火焰上方微微加热，使组织或角质溶解（切勿过热以免产生气泡或烤干）。冷却后，轻轻加压盖玻片使溶解的组织分散并使其透明，驱除气泡并吸去周围多余液体，避免污染盖玻片。镜检观察真菌菌丝和孢子的形态特征。

2）染色标本镜检

（1）乳酸酚棉蓝染色：取洁净载玻片一张，滴加1～2滴乳酸酚棉蓝染液，将被检标本放在染液中，盖上盖玻片后镜检，观察红色毛癣菌、石膏样小孢子菌的染色性和形态结构。

（2）墨汁负染色：将新生隐球菌性脑膜炎患者脑脊液离心后取沉淀置于载玻片上，取一滴优质墨汁与被检标本混合，盖上盖玻片并轻轻压一下，使标本混合液变薄。镜检观察新生隐球菌的形态结构和染色性。

（3）革兰染色：取洁净载玻片一张，滴加1～2滴革兰染液，将被检标本放在染液中，加上盖玻片后镜检，观察白假丝酵母菌的形态结构和染色性。

2.生化鉴定

1）糖发酵实验　将在沙保弱培养基上新培养的白假丝酵母菌、新生隐球菌用无菌生理盐水制成悬液，离心沉淀并反复洗涤后将其菌液接种于含葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖的液体培养基中，并放入小导管，37℃培养24～48 h，观察结果。

2）糖同化实验　取20 mL已灭菌的糖同化培养基冷至48℃，将培养24～48 h的待检菌混悬于4 mL无菌盐水中，调菌液浊度为4麦氏比浊标准，之后将全部菌液加入培养基中，混匀后倾注平板。凝固后，将含葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖的纸片分别贴在平板表面，25℃或37℃孵育24～48 h，观察结果。

3.结果

1）不染色标本镜检　镜检时光线应稍弱，使视野稍暗为宜。先用低倍镜观察有无真菌菌丝和孢子，再用高倍镜观察菌丝、孢子的特征。低倍镜下，菌丝折光性强，呈分枝状排列；高倍镜下，可见菌丝分隔或见不同的孢子形态。10%KOH溶液直接镜检皮肤癣菌菌丝见图14-3。

2）染色标本镜检

（1）乳酸酚棉蓝染色法：酸性染料使真菌被染成蓝色。石膏样小孢子菌乳酸酚棉蓝染色后镜下可见大分生孢子呈纺锤形，具有分隔，每隔为一个细胞。菌丝两侧可有无柄或短柄的少数棍棒状小分生孢子，有时可见厚膜孢子，菌丝呈球拍状、梳状或结节状。石膏样小孢子菌镜下形态见图14-4。红色毛癣菌乳酸酚棉蓝染色后镜下可见菌丝有隔，两侧可见梨形或棒状侧生小分生孢子，有的有较短的小分生孢子柄，大分生孢子较少，壁薄，细长，表面光滑呈棒状。红色毛癣菌镜下形态见图14-5。在陈旧培养基中可见厚膜孢子、关节孢子、球拍状菌丝。

图14-3　10%KOH溶液直接镜检皮肤癣菌菌丝

图14-4　石膏样小孢子菌镜下形态（×1000）

图14-5　红色毛癣菌镜下形态（×400）

（2）墨汁负染色法：新生隐球菌为圆形酵母型细胞，可见芽生孢子，菌体细胞周围包裹一较宽厚的胶质样荚膜，菌体和荚膜不着色，透亮，背景为黑色。新生隐球菌见图14-6。

（3）革兰染色法：白假丝酵母菌革兰染色阳性，着色不均匀，圆形或卵圆形菌体，有芽生孢子及假菌丝。白假丝酵母菌见图14-7。

图14-6　新生隐球菌（墨汁负染色）

图14-7　白假丝酵母菌（革兰染色）

3）糖发酵实验　白假丝酵母菌能发酵葡萄糖、麦芽糖，产生二氧化碳和乙醇，使糖溶液中的指示剂由蓝变黄，且倒插管中有气泡产生，但不发酵蔗糖和乳糖；新生隐球菌不能发酵上述四种糖。

4）糖同化实验　检查被检菌在纸片周围生长与否，如在含糖纸片周围有一明显生长圈为同化该糖。白假丝酵母菌和新生隐球菌对上述四种糖的同化结果均为葡萄糖（+）、麦芽糖（+）、蔗糖（+）、乳糖（-）。

（四）注意事项与小结

（1）KOH溶液的浓度以100 g/L为佳，具体浓度随标本角质层的厚薄而定，角质层增厚则增加浓度，KOH浓度过高易干燥形成结晶，影响结果观察。

（2）若要保存标本，使用等体积的50 g/L KOH和250 g/L甘油的混合液。

（3）乳酸酚棉蓝染液中的乳酸酚对真菌有强杀灭作用。因此，从真菌实验室生物安全角度考虑，为避免真菌孢子扩散，用乳酸酚棉蓝染色时，一定要确保被检标本被染液完全覆盖。

（4）优质墨汁中应加防腐剂防腐，以免细菌生长繁殖，使墨汁中胶体受到破坏，产生颗粒和沉淀现象，影响观察结果。染色时，先用生理盐水稀释墨汁，稀释倍数根据墨汁的浓度（一般2～3倍）或工作经验而定，以镜下背景墨褐色、菌体透亮为准。

（5）直接取临床脑脊液标本经离心后做墨汁负染色检查，可见新生隐球菌的宽厚荚膜，如用新生隐球菌培养物涂片进行检查一般无荚膜，必须将菌种接种到动物体内，待动物发病后，取组织液涂片检查方可见荚膜。

（6）观察真菌的形态结构，对大多数真菌的鉴定起重要作用，从人（或动物）体内或体表采集标本制片检查，发现真菌菌丝或孢子即可初步判断为真菌感染。

（7）凡能发酵某种糖的菌株都同化相应的糖，但同化某种糖的菌株未必就能发酵该种糖。

（五）思考题

（1）为何在甲屑或皮屑中滴加KOH溶液后，还要将标本置于火焰上加热？

（2）直接镜检如何辨别假丝酵母菌？单细胞真菌的假菌丝和多细胞真菌的菌丝有何区别？