一、真菌的分离培养及生长现象观察

（一）目的要求

（1）掌握临床常见病原性真菌的接种、分离培养方法。

（2）熟悉常见病原性真菌的菌落形态。

（二）器材与试剂

1.菌种　浅部感染真菌（絮状表皮癣菌、红色毛癣菌）和深部感染真菌（白假丝酵母菌、新生隐球菌）的沙保弱培养基培养物等。

2.标本　甲屑、皮屑、病发等。

3.培养基　沙保弱培养基（Sabouraud's medium，SDA），马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）等。

4.试剂　无菌生理盐水，70%乙醇，乳酸酚棉蓝染液（LPCB）等。

5.其他　接种钩、接种针、培养皿、无菌试管、无菌镊子、刀片、盖玻片、载玻片、V形玻璃棒、普通光学显微镜等。

（三）步骤与方法

1.标本的接种与分离培养

（1）大试管培养：将甲屑、皮屑、病发等标本先用70%乙醇浸泡2～3 min以杀死杂菌，再用无菌生理盐水洗3次，之后用无菌镊子夹取标本接种于沙保弱琼脂斜面培养基上，置于25～28℃培养1～4周，每日观察生长情况和菌落特征，直至第4周。

（2）平皿培养：将白假丝酵母菌、新生隐球菌接种于沙保弱培养基上，37℃培养3～5天；将絮状表皮癣菌、红色毛癣菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板，25℃培养3～5天，每天观察生长情况和菌落特征。

（3）玻片培养：①取无菌V形玻璃棒放入无菌平皿内；②在V形玻璃棒上放一无菌载玻片；③在载玻片中央加马铃薯葡萄糖琼脂，并制成约1 cm×1 cm方形琼脂块；④在琼脂块的一侧用接种针接种待检菌；⑤将无菌盖玻片盖在琼脂块上，平皿内放少许无菌蒸馏水，盖好平皿盖，于25～28℃培养（酵母菌培养1～2天，皮肤癣菌培养1～7天）；⑥培养后，弃琼脂块于消毒液中，在载玻片上滴加乳酸酚棉蓝染液染色并镜检，观察菌丝和孢子。玻片小培养法见图14-2。

图14-2　玻片小培养法

2.结果

（1）菌体镜下形态和菌落特征：白假丝酵母菌镜下菌体形态为卵圆形，菌落为奶油色类酵母型，菌落底层有假菌丝伸入培养基内，可见芽生孢子；新生隐球菌为圆形，菌落为酵母型，较大，表面光滑湿润，柔软致密，边缘整齐，无气生菌丝；絮状表皮癣菌和红色毛癣菌有气生菌丝，前者菌落初为白色鹅毛状，以后转变为黄色粉末状，后者呈蜡状或粉末状，背面红色，镜下菌丝和孢子形态多种多样（详见浅部感染真菌的鉴定实验相关内容）。

（2）玻片培养：真实反映真菌的自然结构特征，可动态展示真菌生长发育全过程。

（四）注意事项

（1）在进行浅部感染真菌培养时，为避免孢子四处扩散，应用胶带将平板封闭。

（2）菌种最好用真菌的孢子悬液，这样可均匀接种至培养基块的四周。

（3）新生隐球菌37℃培养生长良好，非致病性隐球菌37℃一般不生长。

（4）所有浅部真菌（除花斑癣菌外）、酵母型真菌、孢子丝菌及各种条件致病菌均可用沙保弱培养基进行分离培养，其他深部真菌也常用沙保弱培养基及脑心葡萄糖血琼脂进行分离培养，通过分离培养、菌落特性观察，一般可以初步鉴定是何种真菌。如要进一步检查证实鉴定的正确性，还可做培养物的显微镜下检查和血清学鉴定。

（五）思考题

（1）真菌分离培养的方法有哪些？各适用于哪些类型的真菌？

（2）真菌的菌落形态有何特点？