三、立克次体

（一）临床意义

对人类致病的立克次体主要有普氏立克次体、莫氏立克次体、恙虫病立克次体和Q热立克次体，分别引起流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、恙虫病和Q热。

（二）立克次体的检验程序

立克次体的检验程序见图13-3。

（三）目的要求

（1）掌握外-斐反应的原理、方法和结果判定。

（2）熟悉立克次体的形态、染色特性。

（四）器材与试剂

（1）恙虫病立克次体，小鼠腹膜涂片（姬姆萨染色），Q热立克次体，小鼠脾脏印片（盖梅尼茨染色）等。

（2）姬姆萨染液，盖梅尼茨染液等。

（3）已知抗原OX19、OX2、OXK菌液（每毫升含死菌9亿）。

（4）其他：显微镜、小试管、吸管、记号笔、擦镜纸、载玻片、香柏油、二甲苯等。

（五）步骤与方法

1.标本采集

1）患者血清　无菌采集患者血液3～5 mL，分离血清待用。

2）动物标本制作　普氏立克次体感染后，于一周内尽快采集患者血液并注射入雄性豚鼠腹腔，每日测量体温并观察阴囊是否肿大。若体温超过40℃或阴囊有红肿，则说明有立克次体感染。若无阴囊红肿而体温超过40℃，可取脾组织接种于鸡胚卵黄囊，35℃孵育数日，如卵黄囊膜涂片查出立克次体，可能为普氏立克次体，并根据形态、细胞内部位及免疫荧光法等进行鉴定。

图13-3　立克次体的检验程序

2.染色与形态观察

1）原理　立克次体具有明显的多形性，多呈球杆状，也有球状、短杆状、长杆状及长丝状，大小为（0.3～0.6）μm×（0.8～2.0）μm。经姬姆萨和盖梅尼茨染色后，在油镜下有完整的或破碎的细胞，胞核染成紫红色，胞质染成浅蓝色，在胞质或胞核周围红色（盖梅尼茨染色）或紫色（姬姆萨染色）。

2）方法

（1）姬姆萨染色：标本经火焰固定后，滴加姬姆萨染液，室温染色30 min，水洗待干，油镜下检查。

（2）盖梅尼茨染色：标本火焰固定，加复红染液染3～5 min，水洗；再加孔雀绿染液染30～60 s，水洗，待干，镜检。

3）结果观察

（1）普氏立克次体、莫氏立克次体在油镜下观察，均呈紫红色、球杆状或短杆状，但不同种类的立克次体在细胞中的位置不同，可以以此鉴别。普氏立克次体多聚集成团分布在细胞质中，而莫氏立克次体则在细胞质或细胞核内均可发现。

（2）恙虫病立克次体经姬姆萨染色后，在油镜下呈紫色，可见两端浓染。恙虫病立克次体多在细胞质靠近细胞核处成堆排列，位于细胞质内靠近胞核旁堆积，亦可见散在胞质内及胞质外者，呈多形性，长0.3～0.5μm，宽0.2～0.4 μm。

（3）Q热立克次体经盖梅尼茨染色法染色后，油镜下观察呈鲜红色，为短杆状或球杆状，较其他立克次体小，大小为0.25 μm×（0.5～1.5）μm，亦可见聚集成堆，类似包涵体样集落，位于胞质内或散于胞质外，背景为绿色。

3.病原体培养

1）原理　立克次体必须寄生在活细胞体内，不能在无细胞的培养基上生长，因为其酶系统不完善，不能独立地进行新陈代谢，必须借助于宿主细胞的中间代谢物质转成其所需要的物质和能量。

2）方法　常用的培养方法有动物接种、鸡胚卵囊内接种及组织细胞培养等。

（1）标本采集：取发病后1周内、用抗感染药物前的患者血液5～10 mL、活体组织或尸检材料经处理后接种，注射于雄性豚鼠腹腔。逐日检测豚鼠体温并观察阴囊有无肿大，若体温超过40℃时，可取睾丸鞘膜、脑或脾，制成涂片，寻找细胞内繁殖的普氏立克次体，它一般分散存在于胞质中。若找不到病原体，可用脑组织悬液再接种于豚鼠，盲目传代，以提高分离的阳性率。未死的豚鼠可用已知普氏立克次体抗原检查其血清中有无相应抗体存在。恙虫病立克次体能在广泛的宿主细胞内生长，如恙螨和某些昆虫的第二体腔细胞，虱的中肠细胞，鸡胚纤维母细胞以及哺乳动物的各种细胞等。

立克次体标本应床边接种，1 h内不能接种者应置于-70℃环境中。

（2）培养：

①鸡胚卵黄囊培养：以无菌法取患者发病初期的血液或血块，研磨成悬液并接种于6～8日龄的鸡胚卵黄囊内。一般通过3～4代鸡胚内培养，立克次体即能逐渐适应卵黄囊膜而大量繁殖。立克次体发育旺盛时多在接种后4～8天使鸡胚死亡。

②细胞培养：常用单层细胞培养和空斑技术。普氏立克次体在鸡胚纤维母细胞，鼠胚肌皮细胞，人羊膜细胞和豚鼠、地鼠、猴肾细胞，Hela细胞，Detroit-6细胞等原代细胞与传代细胞中均能获得良好繁殖。恙虫病立克次体可在多种细胞内获得良好发育，如Hela细胞，人羊膜细胞，地鼠、小鼠、豚鼠、家兔肾细胞，地鼠、大白鼠、豚鼠、家兔和猴的睾丸细胞以及鸡胚纤维母细胞等。

③体虱培养：人的体虱对普氏立克次体最为敏感，多用虱肛注射法或皮膜喂虱法。

④动物接种：用小白鼠滴鼻感染培养，用乙醚轻度麻醉小鼠后，将含普氏立克次体的感染材料用注射器针头向小鼠鼻孔滴入0.1 mL，小鼠一般于感染后3～4天发病、死亡。及时解剖，取肺组织，该立克次体在鼠肺中繁殖旺盛。小白鼠和棉鼠对恙虫热立克次体很敏感，豚鼠、地鼠、家兔、猴次之，大白鼠不敏感，多呈无症状感染。

4.血清学检验——外-斐（Weil-Felix）反应

1）原理　利用某些无鞭毛的变形杆菌菌株X2、X19、XK的O抗原（OX2、OX19、OXK）与某些立克次体有共同的耐热耐碱性多糖抗原成分（又称X抗原），可发生交叉凝集反应；且变形杆菌易于培养，故可利用这些变形杆菌的菌体代替立克次体作为抗原，与立克次体感染的患者血清发生试管交叉凝集反应，以检查人或动物血清中的相应抗体，这种交叉凝集反应称为外-斐反应。根据凝集效价判定结果，以辅助斑疹伤寒、恙虫病等立克次体病的诊断。外-斐反应为一种非特异性交叉凝集实验。

2）方法　外-斐反应操作程序见表13-3。

（1）稀释血清：取患者血清，用生理盐水连续作倍比稀释，血清稀释度依次为1∶10，1∶20，…，1∶2560。

（2）取小试管排成3排，每排9支，分别做好标记。在每排的第1～8号试管中分别加入1∶10，1∶20，…，1∶2560稀释的血清各0.5 mL，各排的第9号试管中不加患者血清，只加0.5 mL生理盐水作为对照。

表13-3　外-斐反应操作程序

（3）将OX2、OX19、OXK三种诊断菌液，分别加入三排的1～9号试管内，每管0.5 mL（此时，每支试管中的液体总量为1 mL）。

（4）孵育：充分混匀，放入35℃培养箱或水浴箱内孵箱过夜，18～24 h观察结果。

3）结果判定　本实验所用抗原为O抗原，阳性凝集成颗粒状，故结果判断可以根据凝集效价判定。

（1）首先与对照管比较，观察试管凝集现象，其次判断血清凝集效价。对照管无凝集，再观察实验管凝集情况。根据反应强度以++++、+++、++、+、-符号记录。

++++：上清液完全澄清，细菌凝集块全部沉于管底。

+++：上清液澄清度达75%，大部分细菌凝集成块沉于管底，周围有细小凝块。

++：上清液澄清度达50%，约50%细菌凝集成块沉于管底。

+：上清液混浊，澄清度仅25%，管底仅有少数细菌凝集成块。

-：液体均匀混浊，无凝集块。

（2）以50%（++）凝集现象的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价，报告检测效价。如果超过最后一管则报告＞1∶2560，达不到第一管则报告＜1∶20。

（3）单份血清凝集效价超过1∶160有诊断意义。双份血清（病程早期及恢复期）效价有4倍增高时，方可作为新近感染立克次体的指标。

（4）根据不同抗原排试管凝集的种类，从而推测患者可能感染的立克次体。流行性斑疹伤寒患者对变形杆菌OX19菌株可产生较高效价的凝集反应，尤其在发病2周末，可达最高峰（1∶320～1∶5120）。地方性斑疹伤寒也可出现类似的凝集反应，但凝集效价较低，多在1∶160～1∶640。外-斐反应结果的判断参考表13-4。

表13-4　外-斐反应结果的判断

5.补体结合实验　以颗粒性立克次体抗原做补体结合实验，不仅具有群特异性，还有种特异性，可用来区别流行性斑疹伤寒和地方性斑疹伤寒。立克次体凝集实验阳性反应的出现较外-斐反应早，且有较高的群特异性，用以区别其他立克次体病，如恙虫病、Q热等；地方性斑疹伤寒的阳性反应相对较弱。

6.分子生物学检查　用DNA探针技术或PCR方法检测标本中的普氏立克次体特异性DNA，具有快速、敏感、特异性强等优点，但适用于实验研究，临床上难以常规开展。

7.动物实验　豚鼠对普氏立克次体敏感，发病早期的患者血液接种于雄性豚鼠腹腔，7～10天后豚鼠发热，腹膜刮片检查胞质内可找到大量病原体。豚鼠阴囊仅有轻度发红，并无明显肿胀，以区别于地方性斑疹伤寒。

（六）注意事项与小结

（1）外-斐反应只能协助诊断，不是特异性方法，诊断还应结合临床资料进行综合分析。

（2）外-斐反应中，变形杆菌的诊断菌液，应根据检查的立克次体进行选择，稀释度可以根据具体情况进行调整。

（3）取3～4份血液标本，分别于病程早期、病程10～14天、病后21～28天或更长时间做检查，以确定诊断。

（4）无菌操作，注意生物安全。

（七）思考题

（1）外-斐反应的原理和临床意义如何？

（2）对可疑恙虫病立克次体感染的患者进行病原学诊断，应采集什么标本？如何进行微生物学检查？

（蒋月婷）