二、衣原体（沙眼衣原体）

（一）临床意义

衣原体广泛寄生于人类、哺乳动物及鸟类，仅少数有致病性，能引起人类疾病的有沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体。其中，沙眼衣原体可以引起沙眼、包涵体结膜炎、肺炎、性病淋巴肉芽肿、泌尿生殖道等部位的感染。沙眼衣原体也是最常见的性传播疾病（STD）的重要病原体，男性多表现为尿道炎，并可合并附睾炎、直肠炎等。女性多表现为尿道炎、宫颈炎、输卵管炎、子宫内膜炎、盆腔炎、异位妊娠、不孕不育等；在生产过程中母亲垂直传播，可引起新生儿眼结膜炎和新生儿肺炎。

肺炎衣原体及鹦鹉热衣原体可引起呼吸道感染和肺炎。至少40%的非淋菌性尿道炎是由于衣原体的感染而引起的；由于70%～80%的女性和多达50%的男性感染衣原体后，常常无典型的临床症状，但可成为传染源，所以实验室诊断具有重要作用。

（二）衣原体（沙眼衣原体）的检验程序

衣原体的检验程序见图13-2。

图13-2　衣原体的检验程序

（三）目的要求

（1）掌握沙眼衣原体包涵体的形态特征。

（2）熟悉临床常用衣原体检测方法的原理和步骤。

（3）熟悉胶体金法和免疫荧光直接检测沙眼衣原体的原理、操作及应用。

（四）器材与试剂

（1）沙眼衣原体感染鸡胚卵黄囊膜涂片、沙眼衣原体感染McCoy细胞培养物、姬姆萨染液、PBS。

（2）试剂：荧光素标记的沙眼衣原体单克隆抗体试剂盒、10%碱性缓冲甘油、丙酮，衣原体检测试剂盒、胶体金法检测衣原体试剂盒等。

（3）其他：荧光显微镜、载玻片、盖玻片、湿盒、擦镜纸、香柏油、二甲苯、无菌拭子、普通显微镜、放大镜、小试管、中试管、滴管、记号笔、培养箱或水浴箱等。

（4）包被有抗衣原体脂多糖单克隆抗体-Ⅰ、抗衣原体脂多糖单克隆抗体-Ⅱ和羊抗鼠IgG试纸条。

（5）抗原提取液：溶液A（0.2 mol/L NaOH溶液），每瓶7.5 mL；溶液B（0.2 mol/L HCl溶液），每瓶7.5 mL。

（6）样本处理管、阳性质控品、阴性质控品。

（五）步骤与方法

1.标本采集与处理

根据临床诊断需要，采集沙眼患者眼结膜刮片、宫颈上皮细胞标本或男性尿道上皮细胞、前列腺液、精液以及患者血清等标本。

（1）眼结膜标本：用刮片将沙眼患者睑结膜上的颗粒刮破，用棉拭子或眼结膜刮片用力擦拭创伤面，保证刮片上含有大量上皮细胞，制备成沙眼患者眼结膜刮片。

（2）女性标本：在取样前先洗净宫颈炎患者感染部位的分泌物，用另外的拭子或棉球将宫颈口外区域的黏液抹去，用无菌拭子插入宫颈口1～2 cm旋转取材，旋转拭子15～20 s后取出，不要碰到宫颈外及阴道壁。这样能保证得到更多的柱状上皮细胞，而沙眼衣原体主要寄生在柱状上皮细胞中（所取标本必须含有足量的上皮细胞，即有1000个以上的上皮细胞，以保证诊断的可靠性）。

（3）男性标本：患者在取样前至少1 h内不要小便。用无菌棉拭子插入尿道约2 cm处旋转，静止数秒后取材。

2.直接涂片镜检

（1）原理：衣原体在宿主细胞内繁殖有特殊的生活周期，不同的生长周期可以观察到两种不同的颗粒结构。①原体（EB）：直径为0.2～0.4 μm的小球形颗粒，有胞壁，内有核质和核蛋白体，是发育成熟的衣原体，为细胞外形式。姬姆萨染色呈紫色，马基亚韦洛（macchiavello）染色呈红色。EB具有高度的感染性，在宿主细胞外较稳定，无繁殖能力，通过吞饮作用进入胞内，EB在空泡中逐渐发育、增大成为网状体。②网状体（RB）或称始体：EB通过吞饮作用进入胞内，由宿主细胞包围EB形成空泡，并在空泡内逐渐增大为RB，直径为0.5～1.0 μm，圆形或椭圆形。中央呈纤细的网状结构，无致密拟核，无胞壁，代谢活泼，以二分裂方式繁殖。RB为细胞内形式，无感染性，macchiavello染色呈蓝色。RB在空泡内发育成许多子代EB，也称为包涵体。成熟的EB从宿主细胞中释放，再感染新的易感细胞，开始新的发育周期，整个发育周期需48～72 h。

经姬姆萨染色的衣原体，用显微镜可观察到，它是由EB和RB在上皮细胞质内形成紫色的包涵体，很致密，不同的发育阶段包涵体形态具有特殊的染色性状。RB被染后呈蓝色，可以看到散在的帽形、桑葚形等包涵体形态。散在的RB呈圆形或卵圆形，散在于胞质内，一个上皮细胞可见1～3个或更多；帽形即形如舌帽或瓜皮帽，大小不一，多数由RB连续排列而成，紧扣在细胞核上或稍有间隙；桑葚形的呈圆形或卵圆形，较大，单独或一面依附于细胞核上，由RB和EB堆积而成；也有的包涵体呈填塞型，绝大多数由EB堆积而成，常把整个细胞塞满，将细胞核挤成梭形或其他形状。

成熟的EB为紫红色，与蓝色的宿主细胞质呈鲜明对比。因此，沙眼衣原体包涵体油镜下观察可见上皮细胞胞质内包涵体染成深蓝色或暗紫色；沙眼衣原体包涵体因含有糖原，碘染色染成褐色。

（2）方法：直接用刮取的眼结膜标本，咽拭子，痰、呼吸道黏膜、宫颈细胞或尿道拭子或其他部位标本涂片。将涂片用丙酮固定30 min，PBS冲洗，晾干。加入姬姆萨染液染色30 min，PBS洗涤，干燥，镜检。

（3）结果：根据实验原理进行判定。

3.分离培养　衣原体为专性细胞内寄生，不能用人工培养基培养，可用鸡胚卵黄囊及Hela-299、BHK-21、McCoy等细胞培养，在细胞内形成包涵体。肺炎衣原体培养最好用Hela细胞或Hep-2细胞。

一般取气管或鼻咽吸取物标本，采集后及时接种，经细胞培养，将接种标本的细胞培养管离心，促进衣原体黏附并进入细胞；或在培养管内加入二乙氨基乙基交联葡聚糖，以增强衣原体吸附于易感细胞的能力，提高分离培养阳性率。然后，可通过特异性单克隆荧光抗体法检测，该技术敏感度高、特异性强，如能早期采集标本可在48 h内获得阳性结果。

4.直接免疫荧光法检测沙眼衣原体

（1）原理：针对沙眼衣原体主要外膜蛋白或脂多糖（LPS）的单克隆抗体与标本中相应抗原结合形成抗原抗体复合物，单克隆抗体上标有荧光素，在荧光显微镜下可见到发绿色荧光的原体和始体。此法操作容易，特异性高（83%～99%），敏感度较高（70%～80%），特别是在检测子宫内膜和输卵管等部位的感染时较培养法敏感。

（2）方法：将待检标本拭子及阴性、阳性对照物轻轻涂在载玻片上，自然干燥。将待检标本涂片用丙酮固定30 min，PBS冲洗，晾干。加荧光素标记的单克隆抗体，然后置于湿盒内，35℃，染色45 min。用PBS洗涤，干燥，在涂片中央加1滴10%甘油，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。

（3）结果判定：荧光显微镜下见到发苹果绿荧光的原体和始体为阳性。

阳性对照应在细胞质内见较明亮的黄绿色荧光，其形态呈圆形或卵圆形，可散在也可堆积在胞质中或胞核旁；阴性对照及PBS对照在细胞中无荧光出现。如上述对照结果符合，则观察患者标本的细胞涂片，如果标本上皮细胞胞质中出现上述圆形或卵圆形荧光，数目在10个以上，即可确认为衣原体感染。

如果用沙眼衣原体分型抗体检测，可将沙眼衣原体鉴定到型。

5.胶体金法检测衣原体

（1）原理：应用胶体金免疫层析技术及双抗体夹心的形式建立的衣原体检测方法，用于快速检测女性宫颈和男性尿道中的衣原体。

沙眼衣原体抗原检测（胶体金法）是以硝酸纤维素膜为载体，用抗衣原体脂多糖单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别固化于硝酸纤维素膜的测试区和质控参照区，胶体金标记的另一抗衣原体脂多糖单克隆抗体干片粘贴于标本区，利用微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端（标本区）的标本液体慢慢地向另一端渗移。若标本中有待测特异性抗原，即可与胶体金标记的抗体结合，此抗原抗体复合物渗移至测试区即被固相单克隆抗体所捕获，在膜上显出红色反应线条。过剩的免疫金复合物继续前行，至质控区与固相抗小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显示出红色质控条，此即为阳性结果。如果样本中无衣原体存在，只有质控区显示红色条带，测试区无条带，即为阴性结果。

试纸条上的质控区包被有羊抗鼠IgG，以指示试剂盒反应系统工作是否正常。质控区色带的出现表明：①样本加入量充足；②样本在试纸条上运行正常。

（2）方法：处理样本：将采样拭子放入含有6滴溶液A（含0.2 mol/L的NaOH溶液，7.5 mL）的样本处理管中，室温放置，在处理过程中不断旋转并在管壁挤压采样拭子，使液体不断被挤出，重复多次，处理2 min；然后加入6滴溶液B（含0.2 mol/L的HCl溶液，7.5 mL），旋转并挤压采样拭子，尽量使液体流出，然后按感染物品的处理方法将采样拭子丢弃。将检测试剂盒从密封袋中取出，放置在洁净、干燥和水平的工作台上，标明样本编号或名称。如果检测试剂盒保存于低于室温处，须将检测试剂盒及试剂提前取出，放至室温平衡后方可使用。将样本处理管中已处理的样本滴加2～3滴至试剂的加样孔中。加样10 min后，判读结果。

（3）结果判定：阴性结果：仅质控区有一条红线，检测区无红线出现。阳性结果：质控区和检测区各有一条红线出现。无效结果：质控区不出现红线，则结果无效。应更换新的检测试剂盒重复实验。注意：当检测区红色检测线很强时，质控线可能相对减弱，此属正常。

6.血清学检查　采用补体结合实验，若恢复期血清抗体效价比急性期血清效价增高4倍或4倍以上，即有诊断意义，但无早期诊断意义。微量免疫荧光法（MIF）适用于沙眼衣原体。

7.快速抗原检测　多采用单克隆抗体直接免疫荧光法，还可应用ELISA加入抗衣原体抗体、酶标抗体IgG及底物进行比色定量检测，这两种方法简便敏感。普通PCR技术可检测肺炎衣原体特异性DNA，具有快速、简便、特异的优点，敏感度高于细胞分离技术，但在检测咽拭子标本中效果不够理想，用套式PCR检测可显著提高其敏感度。荧光定量PCR检查尿道和宫颈拭子、初段晨尿等标本中特异性DNA片段，此法敏感度较高，在临床应用中必须注意控制污染以减少假阳性。核酸杂交技术，125Ⅰ标记的沙眼衣原体rDNA探针检测宫颈标本的衣原体，该法检测只需1 h。

（六）注意事项与小结

胶体金法检测沙眼衣原体抗原应注意以下事项。

（1）勿将不同批号的试剂或试剂盒混合使用，切勿混用溶液A和B的盖子。

（2）观察结果时，红线显示的时间根据拭子所采集的衣原体含量不同而变化，有些阳性样本可在60 s后出现结果。为了确保阴性结果，请勿在15 min后判读结果。严格质控实验标准，严格按照要求观察结果，注意鉴别非特异性沉淀线。

（3）收集、处理、储存、丢弃样本和使用试剂盒中的试剂，均应采取适当的预防措施，所有的样本、试剂及对照品均应作为感染性物品处理。

（4）溶液A含有氢氧化钠，溶液B含有盐酸，两者若溅到皮肤上或眼睛内，应立即用大量清水冲洗。

（5）只可用消毒涤纶拭子或细胞刷采集标本，不可用棉拭子取样；处理标本拭子滴加的A、B溶液的用量应相等。

（6）结果阳性表示标本中存在衣原体，但不能区别衣原体的存活状态，不能确定患者为感染者还是带菌者。因此，对患者的最后诊断不能仅仅依靠此实验结果，而必须结合患者的临床表现，做出综合诊断。

（七）思考题

（1）对人致病的衣原体主要有哪些？原体和始体有何区别？

（2）可疑沙眼衣原体感染的患者应采集什么标本？如何进行微生物学检查？