全屏显示专题章节

支原体种类繁多，对人致病的支原体主要有肺炎支原体、人型支原体、解脲脲原体（UU）和生殖支原体等，第一种引起肺炎，后三种引起泌尿生殖系统的感染。在人体泌尿生殖道分离率较高而与泌尿生殖道疾病密切相关的是解脲脲原体，其次是人型支原体。

成人主要通过性接触传播，男性的感染部位在尿道黏膜，女性感染部位在宫颈，新生儿则经母亲生殖道分娩时感染，主要引起结膜炎和肺炎。支原体生殖道感染与非淋菌性尿道炎、宫颈炎有关，此外，可引起前列腺炎、附睾炎、输卵管炎、子宫内膜炎、肾盂肾炎、盆腔炎、流产、死产和不育症等。

（二）支原体（肺炎支原体、解脲脲原体）的检验程序

支原体的检验程序见图13-1。

（三）目的要求

（1）掌握支原体的形态特征、培养特点。

（2）掌握解脲脲原体分离培养技术、鉴定实验的原理和方法。

（3）熟悉肺炎支原体抗体（被动凝集法、ELISA）检测的原理和方法。

（4）熟悉支原体冷凝集实验的原理、方法及临床意义。

（四）器材与试剂

1.培养基　解脲脲原体专用液体培养基、Hayflick培养基及其他固体选择培养基等。

2.试剂　抗解脲脲原体血清、生理盐水、2%的“O”型人红细胞悬液、姬姆萨（Giemsa）染液、抗解脲脲原体血清、肺炎支原体抗体检测试剂盒（ELISA及被动凝集法）、Diene's染液等。

3.其他　普通光学显微镜、放大镜、水浴箱、酶标仪、二氧化碳培养箱或烛缸、无菌管、手术刀片、镊子、小试管、中试管、吸管、微量加样枪、聚苯乙烯微孔板、直径6 mm的无菌滤纸片、载玻片、擦镜纸、香柏油、二甲苯、记号笔等。

（五）步骤与方法

1.标本采集与处理

（1）前列腺液、精液标本：按摩后取前列腺液、精液。

（2）尿液标本：无菌采集非淋菌性尿道炎患者的中段尿，经2000 r/min，离心10 min，取沉渣作为接种物。

（3）血清标本：采集患者血清3～5 mL血液，分离血清待用。

（4）生殖道标本：女性标本，将宫颈口黏液抹去，用无菌拭子插入宫颈内1～2 cm取宫颈分泌物，取材时要在宫颈内旋转并至少停留20 s，以便获得较多的细胞。

（5）眼结膜刮片：用刮片将患者睑结膜上的颗粒刮破，用棉拭子或眼结膜刮片用力擦拭创伤面，以保证刮片上含有大量上皮细胞。

2.直接涂片染色镜检

（1）原理：支原体与细菌、病毒不同，个体微小，大小不一，一般在0.3～0.5 μm之间，很少超过1.0 μm。支原体结构也比较简单，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，呈高度多形性。支原体可呈球形、球杆形、分枝状及丝状等。

（2）方法：将结膜、尿道和子宫颈刮片或组织切片等待检标本，用姬姆萨染液染色，支原体在油镜下呈淡紫色；革兰染色不着色。

1）原理　支原体的培养特性：可以在人工培养基生长，但营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外，还需加入10%～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适pH 7.8～8.0，低于7.0则死亡，但解脲脲原体最适pH 6.0～6.5。

大多数支原体为兼性厌氧，有些菌株初分离时在5%CO2环境生长更好。支原体生长缓慢，在Hayflick（含1.4%琼脂的）固体培养基上（琼脂含量较少）孵育2～3天后，可出现大小不一的、典型的“荷包蛋样”或“油煎蛋样”菌落，圆形（直径10～16 μm），核心部分较厚，向下长入培养基中，周边为一层薄的透明颗粒区。此外，支原体还能在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长。

解脲脲原体产生尿素酶，能分解尿素而产氨，尿素分解生成的碱性物质使含酚红指示剂的UU液体培养基pH升高，液体颜色由黄色变为红色。

人型支原体产生精氨酸酶，能分解精氨酸产氨，精氨酸分解生成的碱性物质使含酚红指示剂的M-H液体培养基pH升高，培养基的颜色由黄色变为红色。培养基中除含有支原体生长所需的马血清、酵母提取液、酚红指示剂、混合抗生素、生长因子、尿素和精氨酸等物质外，还加有抑菌剂，可抑制生殖道中的细菌和真菌生长。

（1）接种：将采集的标本拭子插入单一的UU或M-H液体培养瓶，在靠近液面上方的瓶壁挤压旋转拭子数次，使拭子中标本渗入；若为精液、前列腺液标本，取200 μL加入培养基中；若为中段尿，取离心后沉渣200 μL加入UU或M-H液体培养基中，将标本与液体培养基充分混匀。

（2）培养：将已经接种的培养基置于5%～10%CO2环境中，37℃恒温箱孵育24～48 h，观察培养基颜色的变化。当液体培养基的颜色由黄色变为粉红色时，再取0.2 mL液体菌液转种于固体培养基，放置于5%～10%CO2环境中，35℃培养1～5天，每天观察培养基颜色的变化，待固体培养基出现红色菌落后，用低倍镜或放大镜下观察支原体菌落特征。

（3）菌落染色：在平板上选择一个菌落用刀片切下带菌落的琼脂块，置于载玻片上，菌落面朝下；然后将载玻片斜置于90℃左右热水缸中，待琼脂溶化后取出，放入另一个90℃热水缸中洗掉表面琼脂，待自然干燥，经姬姆萨染色。

（4）生化反应：一般来说，能分解葡萄糖的支原体不能利用精氨酸，而能利用精氨酸的支原体不能分解葡萄糖，据此可鉴别支原体类型；解脲脲原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作氮源。

（1）当液体培养基的颜色由黄色变为粉红色、培养基澄清，可初步判断为解脲脲原体阳性。

（2）用低倍镜观察，镜下可见菌落被染成紫色，中央深，四周较浅，形状似油煎蛋样，此时可判定支原体阳性。

4.生长抑制实验（growth inhibition test，GIT）

1）原理　GIT是将吸附有支原体型特异性抗血清的滤纸片，置于接种有支原体的固体培养基上，经孵育后出现同型血清抑制该型支原体生长的现象。

2）方法　从可疑解脲脲原体生长的液体培养基中，吸取0.3 mL培养液涂布于固体平板上，无菌滤纸片以0.025 mL解脲脲原体抗血清浸湿，贴在平板上，置于5%～10%CO2、35℃恒温箱中培养，直到显微镜下可见到菌落时再进行判定。

3）结果判定　纸片周围出现抑制生长环者，GIT为阳性，即可确定可疑支原体为解脲脲原体。

5.代谢抑制实验（metabolic inhibition test，MIT）

1）原理　MIT是将支原体接种在含有抗血清的葡萄糖（酚红）培养基中，若抗体与支原体型别相对应，则抑制该支原体分解葡萄糖，酚红不变色。

2）方法　取解脲脲原体专用液体培养基0.8 mL，加入抗解脲脲原体血清0.1 mL作为实验管，另一支培养基0.9 mL不加血清作为对照管，在两支试管中分别加入可疑解脲脲原体的液体培养物0.1 mL，置于5%～10%CO2、35℃恒温箱中培养2～3天后观察结果。

3）结果判定　如果对照管颜色变红而实验管颜色不变，则MIT为阳性，即可确定可疑支原体为解脲脲原体。

1）原理　解脲脲原体能产生脲酶使尿素分解，并产生大量的氨，使含酚红指示剂的UU液体培养基的pH升高呈碱性，液体颜色由黄色变为红色。

2）方法　用无菌接种环挑取解脲脲原体培养物少许，接种于含有尿素及酚红指示剂的UU液体培养基中，37℃培养，每日取出观察结果一次。

3）结果判定　培养基由黄色转变为红色为脲酶实验阳性。

1）原理　肺炎支原体感染患者的血清中常产生冷凝集素（非特异性，成分实质是IgM），在0～4℃情况下，可与人“O”型红细胞或自身红细胞发生凝集。凝集反应具有可逆性，已凝集的红细胞在37℃环境下，凝集现象即消失，可用于支原体感染的辅助诊断。

2）方法　首先将待检血液分离血清后，用生理盐水洗涤红细胞3次，并制成2%红细胞生理盐水悬液；或用正常人“O”型抗凝血配成2%红细胞悬液。取10支小试管置试管架上排成一排，每管加生理盐水0.5 mL。于第1管中加入被检血清0.5 mL，混匀后吸出0.5 mL至第2管，并依次倍比稀释至第9管，并从第9管中弃去0.5 mL；此时，血清稀释度依次为1∶2，1∶4，…，1∶512。最后一管不加待检血清，作为阴性对照。然后，在每支试管中分别加入2%人“O”型红细胞或自身红细胞悬液0.5 mL，摇匀，置于4℃冰箱2～4 h观察结果或过夜，次日观察结果，具体操作程序见表13-1。

3）结果判定　根据有无凝集和凝集的程度判定结果。

（1）从冰箱内取出试管后，必须立即观察结果（取出时尽量避免振动）。

（2）先观察试管底部红细胞沉淀形状，再轻摇试管，对照管内的红细胞，轻摇后应完全分开，无凝集现象；实验管如有明显的凝集现象，记录凝集效价。

（3）将已凝集的试管再放入37℃恒温箱孵育5～30 min，重新观察，如红细胞完全分开，凝集块消失，则证实为真正的冷凝集现象。

（4）通常效价在1∶64以上有辅助诊断意义，效价越高或双份血清（恢复期与感染初期）呈4倍以上升高，表明可能有支原体近期感染。

8.肺炎支原体血清学诊断（被动凝集法）

1）原理　试剂用肺炎支原体（Mac株）细胞膜成分致敏人工明胶粒子制造而成，这种致敏颗粒和标本中的肺炎支原体抗体结合时可发生凝集反应，由此通过被动凝集反应来检测血清中的肺炎支原体抗体效价。

2）方法　按试剂盒说明书操作，半定量实验做10孔或以上，具体操作见表13-2。

（1）用微量滴管将血清稀释液滴入微量反应板第1孔中，共计4滴（100 μL），从第2孔至最后一孔各滴入1滴（25 μL）。

（2）用加样枪取样本25 μL至第1孔中，混匀后取25 μL加入第2孔中，依次类推倍比稀释至最后一孔取25 μL弃去。

（3）用试剂盒中提供的专用滴管（每滴25 μL）在第2孔中滴入1滴未致敏粒子，从第3孔至最后一孔各滴入1滴致敏粒子。

（4）用平板混合器以不会导致微量反应板内容物溅出的强度混合30 s，加盖后于室温（15～30℃）水平静置。3 h后观察结果（24 h不影响结果判定）。

（5）同时设阳性对照，操作方法与样本相同。

（1）判定标准：凡出现明胶颗粒凝集者为阳性反应，不出现凝集者为阴性反应。

-（不凝集）：颗粒呈纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。

±（可凝）：粒子形成小圆环，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。

+（凝集）：粒子环明显变大，外周边缘不均匀且杂乱地凝集在周围。

++（强凝集）：产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展。

阳性：样本与未致敏粒子（最终稀释倍数1∶20）的反应判定为阴性（-），而与致敏粒子（最终稀释倍数1∶40以上）的反应判定为阳性（+）或（++）时，最终判定为阳性，以显示反应为阳性（+）时的最高稀释倍数作为抗体滴度。

阴性：无论样本与未致敏粒子呈现何种反应，只要与致敏粒子（最终稀释倍数1∶40）的反应显示为阴性（-）时，最终判定即为阴性。

可疑：未致敏粒子（最终稀释倍数1∶20）的反应判定为阴性（-）且致敏粒子（最终稀释倍数1∶40）的反应判定为可疑（±）时，最终判定为可疑。

9.肺炎支原体血清学诊断（间接ELISA）

1）原理　用肺炎支原体抗原包被微量板孔，制成固相载体。滴加患者血清后，其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。然后，加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔（或人）IgG、IgA和IgM血清，使之与上述免疫复合物反应。再加入底物（对硝基苯磷酸盐），该反应产生有色产物，颜色深浅与特异性抗体含量成正比。

2）方法　将待检血清用样本稀释液稀释，已稀释的样本加入板孔内，同时设阳性、阴性对照，37℃孵育60 min。以洗涤缓冲液重复洗涤板3次，洗板，除去多余的结合物。加入酶结合物于相应孔内，37℃孵育30 min。以洗涤缓冲液重复洗涤板3次，洗板，除去多余的结合物。按顺序分别加入底物，37℃孵育30 min。终止反应，每孔内加入终止液，轻微振荡微孔板以混合溶液。以空白孔调零，用酶标仪测定各孔的OD值。

3）结果判定　首先根据阳性和阴性对照结果，判断实验是否成功。然后根据判定待测样本的OD值判定其是阳性或阴性。

检测抗MP-IgM抗体可以作为MP感染的早期诊断，适用于年轻人，尤其是儿童的感染，检测抗MP-IgG抗体，则需依靠IgG抗体滴度，恢复期比发病初期有4倍升高，方可做出诊断。

10.解脲脲原体核酸扩增荧光定量检测

1）原理　用一对解脲脲原体特异性引物和一条解脲脲原体特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法定量检测解脲脲原体（UU）DNA。

2）方法　取尿液离心沉淀物、前列腺液、精液及女性生殖道标本。立即用于测试，也可保存于-20℃，待测，保存期为6个月。标本长途运送时应采用0℃冰盒。

（1）阴性质控品处理：向阴性质控品管加入等量DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10 min，12000 r/min离心5 min备用。

（2）标本处理：向标本管中加入1 mL灭菌生理盐水，充分振荡混匀，挤干棉拭子。吸取全部液体转至1.5 mL离心管中，12000 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀加灭菌生理盐水1 mL混匀，12000 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀中加入50 μL DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10 min，12000 r/min离心5 min备用。UU弱阳性质控品处理（同阴性质控品）。UU强阳性质控品处理（同阴性质控品）。UU阳性定量参考品处理：8000 r/min离心数秒，备用。

（3）PCR扩增：加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后样本（标本或阴性或弱阳性、强阳性质控品）上清液2 μL，或直接加入阳性定量参考品2 μL，8000 r/min离心数秒，放入仪器样本槽。打开Instrument窗口设置循环条件：93℃，2 min→93℃，45 s→55℃，60 s→10个循环，93℃，30 s→55℃，45 s→30个循环。保存文件，运行。

（4）结果分析：反应结束后保存检测数据文件。分析条件设置：根据分析后图像调节Baseline的Start值、Stop值以及Threshold值，并点击Manual设定阈值（可设Start值2～6，Stop值6～10），使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即Correlation数值介于-0.97～-1.0，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。到Tray窗口，记录未知标本数值。