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钩端螺旋体（简称钩体）在自然界广泛存在，它可在淡水、潮湿的土壤、植物和淤泥存活很久，可感染人类、野生动物和家畜（尤其是啮齿目动物）。人类若接触被污染的水源、食物、土壤，钩端螺旋体可经皮肤破损处、黏膜表面进入人体，引起钩端螺旋体病（简称钩体病）。钩端螺旋体病的临床类型较多，临床症状轻重不一。轻者可为轻微的自限性发热；重者可出现急性炎症性肝损伤、肾损伤的症状（如黄疸、出血、尿毒症等），也可出现脑膜的炎性症状（如神志障碍和脑膜刺激征等）；重者甚至可因肝、肾衰竭，肺脏大出血而死亡。

（二）钩端螺旋体检验程序

钩端螺旋体检验程序见图12-2。

（三）目的要求

（1）掌握钩端螺旋体的形态特征、暗视野及镀银染色检查方法。

（2）熟悉钩端螺旋体的分离培养特性、方法。

（3）熟悉钩端螺旋体显微镜凝集实验的原理、方法、结果判断。

（四）器材与试剂

（1）培养基：柯氏（Korthof）培养基、含100～400 μg/mL 5-FU的柯氏培养基等。

（2）菌种：已知血清型的钩端螺旋体液体培养物。

（3）试剂：与上述菌种同型的钩端螺旋体抗血清、冯泰那镀银染液，负染液（2%刚果红溶液、1%盐酸-乙醇溶液）等。

（4）其他：暗视野显微镜、无菌吸管、荧光显微镜、水浴箱、载玻片、牙签、生理盐水、试管、滴管、盖玻片、生理盐水、火柴、酒精灯、接种环、记号笔、吸水纸、擦镜纸、二甲苯、香柏油等。

（五）步骤与方法

（1）对于疑似钩端螺旋体病患者，发病10天内取血液，2周后取尿液，有脑膜刺激症状者取脑脊液。

（2）采集患者静脉血液，分离血清进行血清学诊断。

2.染色及形态观察

（1）暗视野显微镜检查：取钩端螺旋体培养物制成压滴标本。将标本片置于载物台上，上升聚光器使镜油与标本片紧密接触。先用低倍镜对光，至能清楚观察到标本中的物体为止。然后在标本上滴加镜油，在暗视野下用油镜观察。

（2）冯泰那镀银染色检查：取清洁载玻片一张，加钩端螺旋体培养物一滴。待其自然干后滴加固定液，固定1 min，用无水乙醇冲洗。滴加媒染剂，加温至有蒸汽冒出，作用30 s，水洗，待干镜检。

（3）刚果红染色法（负染色法）：取20%刚果红溶液一小滴于载玻片上，用牙签取样本与之混匀，涂布成均匀厚片，待干，以1%盐酸-乙醇溶液洗涤，待其自然干后镜检。

（4）结果判定：

①暗视野显微镜下特征：在黑的背景下，可见钩端螺旋体像一串发亮的微细珠粒，一端或两端弯曲呈钩状，有时菌体屈曲呈S形或C形，以长轴为中心，做回旋运动，或以波浪式朝水平方向前进。

②镀银染色法的形态特征，镜下背景为淡黄褐色，钩端螺旋体呈褐色或棕黑色，一端或两端呈钩状弯曲，呈S或C形，细密的螺旋镜下看不清楚。

③经刚果红染色，螺旋体无色，背景为蓝色。

（1）血培养：应采集早期（发病1周之内）未用药治疗前的血液1～2 mL。为避免血中抗体或其他抑制物的作用，每支5 mL培养基接种血液0.1 mL左右，如患者曾用青霉素治疗，则可在培养基中加入1500 U/mL青霉素酶，每份标本可同时接种3支Korthof培养基（含有10%的正常兔血清），经28℃培养7～14天。

（2）尿液培养：取患者发病后2～5周的中段尿30～50 mL，经3500～4000 r/min离心1 h，取沉渣0.3～0.5 mL接种到2～4管Korthof培养基中，为防止尿液被杂菌污染，可在培养基中事先加入抑制杂菌的试剂（每毫升培养基中加入5-FU 250 μg）。酸性尿液者应在检测尿液前一晚服小苏打2～4 g，使尿呈中性或弱碱性。

（3）其他检材：如有脑膜刺激症状和其他神经系统症状的患者，可取脑脊液0.5 mL培养。也可取动物内脏（肝、肾）小组织块、疫水和土壤等分离钩端螺旋体。

（4）鉴定：上述培养物呈轻度混浊，取离心沉渣经暗视野或镀银染色等显微镜检查，如有问号钩端螺旋体存在，则用已知诊断血清鉴定其血清群和血清型。

（5）菌株分群、分型：应用分群血清与新分离的钩端螺旋体做凝集实验，确定菌群。应用交叉凝集素吸收实验或分型因子血清来确定菌型。

（6）结果判断：从分离培养的第三天起，每天或每隔3～5天，取培养物用暗视野显微镜检查一次，如有钩端螺旋体生长，培养基呈云雾状混浊，在暗视野显微镜下，即可观察到运动活泼的钩端螺旋体。连续观察30天，若无钩端螺旋体生长，方可判为阴性。大部分阳性标本可在7～14天有生长表现（一般培养的第7～10天为繁殖高峰）。

1）显微镜凝集实验（MAT）

（1）原理：钩端螺旋体可与同型免疫血清结合产生凝集现象。当血清高倍稀释时，镜下可见钩端螺旋体呈蜘蛛样凝集（数根钩端螺旋体的一端连在一起，另一端呈放射状散开）；当血清做低倍稀释时，血清中的补体可导致凝集的钩端螺旋体溶解破坏（血清中的补体使凝集的菌体在数分钟内发生溶解），因而镜下见钩端螺旋体呈残絮状、颗粒状、蝌蚪状，本实验既可鉴定钩端螺旋体的型别，也可用于测定患者血清中特异性抗体的效价。

（2）方法：微孔板法显微镜凝集实验的具体操作如下。

①抗原制备：取标准菌株（通常用参考株或用当地流行株）4～7天的培养物，每个视野可见50～60条活钩端螺旋体，运动活泼，无自凝现象者。

②实验方法：取患者血清（急性期、恢复期两份血清，经56℃30 min灭活），用pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释成1∶50，1∶100，1∶200，…，1∶1600或更高稀释度，取不同稀释度血清0.1 mL置于有机玻璃板凹孔内。分别加入等量的我国15个型标准钩端螺旋体菌液或当地流行常见菌型的活菌抗原，同时用生理盐水作抗原对照。轻摇混匀后置于28～30℃温箱中2 h，然后从每管中取出1滴于载玻片上，覆盖盖玻片，在暗视野显微镜下观察结果。

（3）结果判断：++++表示几乎全部钩端螺旋体凝集，呈蝌蚪状或折光率高的团块或残片，偶见极少数游离活钩端螺旋体；+++表示有75%以上菌体凝集或溶解；++表示有50%以上菌体凝集或溶解；+表示有25%以上菌体凝集或溶解。-表示全部钩端螺旋体正常，分散存在，无凝块，菌数与对照相同。

2）间接凝集实验（indirect agglutination test，IAT）将钩端螺旋体的属特异性抗原吸附于载体颗粒上，再与患者血清作用，若待检血清中有相应抗体，则出现凝集现象，常用载体颗粒有活性炭、胶乳颗粒和干血细胞等。单份血清标本活性炭凝集效价＞1∶8、胶乳凝集效价＞1∶2，可判定为阳性，双份血清标本效价呈4倍以上增长则更有诊断价值。这类方法的特异性虽不及显微镜凝集实验，但有快速、简便的特点，便于一般实验室使用，也可作为钩端螺旋体的筛选实验。

3）酶联免疫吸附实验（ELISA）

（1）原理：将高度纯化的已知钩端螺旋体抗原包被反应板之后加入待检血清，若待检血清中存在相应的钩端螺旋体抗体（一抗），则与包被的已知钩端螺旋体抗原特异性结合。再加入酶标记的羊抗人IgG（二抗），即在固相载体上形成“抗原-抗体-酶标记羊抗人IgG”复合物，当加入酶底物后，可呈现颜色反应。颜色的深浅与血清中钩端螺旋体抗体量成正比。

①稀释血清：将待检血清用PBS按1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200倍比稀释。

②加样：取已包被钩端螺旋体抗原的酶标板，将稀释好的阳性血清、阴性血清及样本血清分别加入酶标板孔中，每孔100 μL，同时加入2孔空白对照（PBS）。37℃放置60 min，弃去孔中液体。

③洗板：于各孔内加入洗涤液250 μL，洗板3次。

④加酶标记物：每支酶标羊抗人IgG用0.5 mL三蒸水充分溶解均匀后，再用PBS按1∶50稀释，每孔加稀释好的酶结合物100 μL。37℃放置40 min。

⑤洗板：于各孔内加入洗涤液250 μL，洗板3次。

⑥显色与终止：加底物液A、底物液B各1滴。室温避光显色，10 min后，每孔加终止液1滴，终止反应。

（3）结果判定：采用波长405 nm的酶标仪测定OD值，阴性OD值×2.1作为判定界值。检测样本的OD值≥此判定界值则为阳性。

（六）注意事项

（1）ELISA血清标本应新鲜、无污染；加入试剂力求准确，一般用微量加样枪加样；反应板洗涤必须充分、彻底，以免影响判定结果；结果测定应以酶标仪读数为准。

（2）实验所用标本、试剂及废弃物应按生物危险品进行处理。

（3）血液培养时，为避免血液中抗体等因素的抑制作用，多采用小剂量接种。但接种量越小，阳性培养率越低，一般血液与培养液的比例以1∶（10～20）为宜。

（4）钩端螺旋体显微镜凝集实验特异性高，能区分群、型，但群、型较多，各地流行株不止一种，因此，在做流行病学调查时，常用非致病性的水生双曲钩端螺旋体帕托克株作为广谱抗原测定抗体进行初筛，然后对阳性者再用当地流行菌株进一步确定群、型。

（5）进行钩端螺旋体分离培养时，要根据患者发病时间采集不同类型的标本，发病1周内采集血液标本，发病2周要用尿标本，否则会影响检测结果，出现假阴性。