一、梅毒螺旋体

（一）临床意义

梅毒螺旋体是人类梅毒的病原体，主要经性接触传播，也可通过间接接触或经手术、输血等途径传播，患梅毒的孕妇可引起流产、早产、死产或通过胎盘感染胎儿导致先天性梅毒。梅毒的病程长，危害性大，早期检出具有重要意义。

（二）梅毒螺旋体的检验程序

梅毒螺旋体检验程序见图12-1。

图12-1　梅毒螺旋体检验程序

（三）目的要求

（1）熟悉梅毒螺旋体的形态特征、暗视野及镀银染色检查方法。

（2）掌握梅毒螺旋体的血清学筛选和证实实验的原理、方法、临床意义。

（四）器材与试剂

（1）培养基：柯氏（Korthof）培养基、含100～400 μg/mL 5-FU的柯氏培养基等。

（2）其他：暗视野显微镜、无菌吸管、荧光显微镜、载玻片、生理盐水、试管、滴管、盖玻片、生理盐水、火柴、酒精灯、接种环、记号笔、吸水纸、擦镜纸、二甲苯、香柏油等。

（五）步骤与方法

1.采集标本

（1）采集下疳分泌物及皮疹渗出液时，先用生理盐水棉球擦净病变部位的污秽物，或用钝器刮破皮疹面露出基底组织，用棉球挤压周围组织，使分泌物或渗出液溢出，然后用盖玻片刮取分泌物等，覆盖于已加一滴生理盐水的载玻片上备检。

（2）取穿刺液：用注射器注射0.3～0.5 mL生理盐水至局部淋巴结或组织内，反复抽吸数次，最后将液体尽量吸入注射器内，取穿刺液0.01 mL滴于载玻片上备检。

（3）组织块是无菌手术切下的小块组织，剪碎，置于乳钵中研磨，加少量生理盐水制成组织悬液。

（4）采集患者静脉血液，分离血清进行血清学诊断。

（5）采集的标本应及时送检，若不能及时送检，应保存于-70℃或液氮内。应用二甲基亚砜（10%）或甘油（15%）作为冷冻保护剂。血清或血浆等标本应保存于4℃或-20℃。需远途送检的血液标本，可将血滴于玻璃纤维片上，室温干燥。检验前用磷酸盐缓冲液洗脱2 h，洗脱液用于血清学实验。

2.染色及形态观察　取渗出液涂片后直接于暗视野显微镜下观察，或采取初期及二期梅毒硬性下疳、梅毒渗出物等用暗视野或墨汁显影，如查见运动活泼的密螺旋体即可诊断；或镀银染色镜检。

（1）暗视野显微镜观察法：先在载玻片上加无菌生理盐水1滴，用无菌生理盐水棉球擦净病变部位，用钝刀刮破病损处表面组织（避免出血），再用棉球挤压周围组织或使组织液渗出，用毛细管吸取下疳的渗出液，将组织渗出液与载玻片上无菌盐水混匀，加盖玻片后镜检。取自皮疹、淋巴结或组织穿刺液等也可用于检查，但阳性率较低。打开暗视野显微镜，在聚光器上加一滴蒸馏水（湿式），将载玻片置于载物台上。上升聚光器使蒸馏水接触载玻片的底部，先用低倍镜调焦，再用高倍物镜观察。

（2）冯泰那镀银染色法：取载玻片于中央加生理盐水1滴，取样本少许与生理盐水混匀做涂片或取溃疡渗出物直接涂片；待涂片干燥后滴加固定液，固定1 min后，用水冲洗；滴加媒染剂，加热至有蒸汽出现，作用0.5 min，水洗；加硝酸银染液，微加温，染色约0.5 min，水洗，待其自然干后镜检。

（3）刚果红染色法（负染色法）：取20%刚果红溶液一小滴于载玻片上，用牙签取样本与之混匀，涂布成均匀厚片，待干，以1%盐酸-乙醇溶液洗涤，待其自然干后镜检。

（4）结果判断：

①在暗视野显微镜下直接镜检，适用于初期梅毒的检查。有发光的典型螺旋状螺旋体及特征性运动方式（旋转运动、屈伸移行、弯曲前行）为阳性结果。如见典型形态特征、有特殊运动方式的密螺旋体，结合临床症状及病史，可初步报告为：疑为梅毒螺旋体。

②经冯泰那镀银染色，在油镜下可见背景呈淡黄褐色，梅毒螺旋体呈棕褐色或棕黑色，菌体直硬、小而纤细、中间略粗、两端尖直，有8～14个规则的、紧密缠绕的螺旋，螺旋细密而规则。

③经刚果红溶液染色，螺旋体无色，背景为蓝色。

3.分离培养　梅毒螺旋体的人工培养问题迄今仍未解决。Fieldsteel等用棉尾兔上皮细胞在降低氧分压及1.5%O2、5%CO2、93.5%N2、33℃的最佳培养条件下进行梅毒螺旋体组织培养获得成功，对梅毒螺旋体的研究起了积极的作用，但此法条件要求高，仅适用于实验室研究。

4.血清学检验　梅素螺旋体有三类抗原成分。一是螺旋体表面特异性抗原，刺激机体产生特异的凝集抗体及密螺旋体制动或溶解抗体，后者加补体可溶解螺旋体。二是螺旋体内类属抗原，可产生补体结合抗体，与非病原性螺旋体有交叉反应。三是螺旋体与宿主组织磷脂形成的复合抗原，当螺旋体侵入组织后，组织中的磷脂可黏附在螺旋体上，形成复合抗原，此种复合抗原可刺激机体产生抗磷脂的自身免疫抗体，称为反应素。其中，第一类是特异性抗体（抗TP抗体），后两类为抗类脂质的非特异性抗体。

梅毒的血清学诊断实验中，快速血浆反应素环状卡片实验和甲苯胺红不加热血清实验（TRUST）是非螺旋体抗原实验。它是用正常牛心肌的心磷脂作为抗原，检测患者血清中的反应素。反应素在第一期梅毒病变出现后1～2周就可测出，第二期梅毒反应素阳性率几乎达100%，第三期梅毒反应素阳性率较低。快速血浆反应素实验（RPR）是非特异性实验，虽敏感度较高，但所用抗原是非特异性类脂抗原，除梅毒病以外，某些自身抗体免疫疾病和其他螺旋体病（回归热等）、麻风、红斑狼疮、非典型肺炎、类风湿关节炎、肝硬化等亦可查出反应素，称为梅毒血清生物学假阳性。检测抗体时应排除假阳性反应，结合病史、临床表现及多次的实验结果进行分析。目前，国内RPR和TRUST这两种实验常用于梅毒人群筛选，实际工作中可根据情况选用其中一个进行梅毒螺旋体抗体筛选实验。

由于某些患者不出现皮肤黏膜损伤，无法采集分泌物标本，可采用血清学检查方法。当人体感染梅毒螺旋体4～10周后，血清中可产生一定数量的抗类脂质抗原的非特异性反应素和抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体。根据检测所用的抗原不同，血清学实验可分为两种类型，即非特异性梅毒螺旋体抗原血清学实验与梅毒螺旋体抗原血清学实验。

1）非特异性梅毒螺旋体抗原血清学实验　用正常牛心肌的心脂质（cardiolipin）作为抗原，测定患者血清中抗心脂质抗体（亦称反应素）。本实验敏感度高、特异性低，且易发生假阳性，早期患者经充分治疗后，反应素消失，目前一般作为筛选和定量检测；也可作为观察疗效、复发及再感染的指标。实验方法有以下几种。

（1）性病研究实验室（venereal disease research laboratory，VDRL）实验：

原理：美国Pangborn等发现一种性病研究实验室（VDRL）抗原，是从牛心肌中提取的心磷脂，适量加入胆固醇及卵磷脂以提高敏感度。VDRL实验属于微量玻片法，可与患者血清中抗心脂质抗体（亦称反应素）结合，出现凝集现象，是唯一推荐用于检测脑脊液反应素的实验，对诊断神经梅毒具有重要价值，可做定量及定性实验，操作简单，试剂及对照血清已标准化，费用低。但对一期梅毒敏感度不高。

方法：取灭活的患者血清0.05 mL加在玻片圆圈中，用注射器加入VDRL抗原悬液1滴，同时设阴、阳性对照。将玻片摇动5 min充分混匀后判定结果。判定结果需在10×10倍显微镜下进行。

结果判断：阳性（++～+++）：大片或中等大小聚合块状物。弱阳性（+）：细小凝聚物。阴性（-）：液体混浊，颗粒分布均匀。阳性或弱阳性血清再做定量实验，用生理盐水将血清做倍比稀释，原血清1/2，1/4，1/8，…，1/64等6个稀释度。用同样步骤操作，以“++”凝集的血清最高稀释度作为其效价。

（2）快速血浆反应素实验（RPR）：

原理：用未经处理的活性炭吸附VDRL抗原，此颗粒如与待检血清中的反应素结合，便形成黑色凝集块，可用肉眼观察结果，不需显微镜，敏感度提高，也易于推广。也可将标本倍比稀释，进行半定量实验，半定量实验对评价疗效和判断是否再感染有一定的价值。

方法：与VDRL实验方法相似。

结果判断：同VDRL实验。

（3）甲苯胺红不加热血清实验（toluidine red unheated serum test，TRUST）：

TRUST原理与RPR原理相同，TRUST抗原中加入甲苯胺红染料颗粒代替碳颗粒作为指示物，使阳性结果出现红色絮状凝集现象，阴性结果为甲苯胺红颗粒凝聚于中央一点或均匀分散。实验方法和结果判断同RPR。定性实验呈阳性的标本，可在反应卡上将血清用生理盐水倍比稀释，然后按定性实验方法再做半定量实验。

2）梅毒螺旋体抗原血清学实验　用死的或活的梅毒螺旋体或其成分作为抗原测定患者血清中的特异性抗体。这种方法敏感度与特异性均高，一般用作证实实验。

（1）荧光密螺旋体抗体吸收实验（fluorescent treponemalantibody absorption test，FTAABS）：

原理：此法为间接荧光抗体法，将待检血清先用非致病性密螺旋体进行吸收，除去能与梅毒螺旋体发生结合的非特异性抗体。经吸收处理的血清，在玻片上与梅毒螺旋体抗原结合，再用荧光素标记的抗人丙种球蛋白抗体染色，在荧光显微镜下观察，如有发荧光的螺旋体即为阳性。

方法：①制备抗原片：用Reiter株梅毒螺旋体（每高倍镜视野20条）抗原悬液，在玻片上涂数个直径为5 mm的菌膜，待干后用甲醛（醇）固定。②待检血清预处理：待检血清先经56℃30 min灭活，取50 μL血清与200 μL吸附剂（Reiter株非致病性密螺旋体）混匀，37℃作用30 min，以充分吸附非特异性抗体。③荧光染色：吸附后待检血清用PBS做1∶（20～320）的倍比稀释，将已稀释的血清分别滴加于抗原片上，置于湿盒内37℃作用30 min，然后将玻片在PBS中浸洗，换液3次，每次5 min，用吸水纸吸干。于各抗原反应片上滴加荧光素标记的羊抗人IgG抗体，置于湿盒内37℃作用30 min，再用PBS洗片（方法如前），待玻片干后用甘油缓冲液封片。

实验应设阳性、阴性及非特异性血清对照。阴性标准血清无荧光菌体或偶见荧光菌体出现；阳性对照可见多数（高倍镜视野15条）荧光菌出现。并以此参照做出待检标本的判定。

观察判断：将染色片置于荧光显微镜下，参照阳性标准血清的荧光强度判定结果。每高倍镜视野若半数（10条左右）出现荧光，则为++；多于半数（15条左右）出现荧光，则为+++；全部（20条）出现强荧光，则为++++。“可疑”结果参照非特异性血清的荧光强度判断为++或+，阴性结果参照阴性对照血清判定为-或+。凡++～++++者，可确诊为梅毒螺旋体感染。

（2）酶联免疫吸附实验（ELISA）：

原理：采用双抗原夹心法，将高度纯化的TP抗原包被反应板之后加入待检血清，若待检血清中存在TP抗体，则与TP抗原特异性结合。再加入酶标记的高纯度TP抗原，即在固相载体上形成“TP抗原-抗TP抗体-酶标记TP抗原”夹心复合物，当加入酶底物后，可呈现颜色反应。颜色深浅与血清中抗TP抗体量成正比。

方法：分别取待检血清，阴性及阳性对照血清各50 μL，加于反应板相应凹槽中；每孔再加入酶标记TP抗原各50 μL。混匀，37℃30 min。取出反应板，弃尽孔中液体。用洗涤液洗板6次，拍干液体。每孔加酶底物各100 μL，37℃，15 min后，加终止液50 μL。用酶标仪于450 nm波长读取吸光度值（A），以空白对照调零。分别测定阴性、阳性对照及待检血清的A值。

结果判断：待检血清A值≥CO值，为阳性；待检血清A值＜CO值，为阴性。

CO=0.20+阴性对照平均A值。阴性对照A值应≤0.12，阳性对照A值应≥0.30；阴性对照A值＜0.03时，按0.03计算。

（3）梅毒螺旋体制动实验（TPI）：用来检测血清中是否存在抑制螺旋体活动的特异性抗体。用活梅毒螺旋体（Nichol株）加患者新鲜血清，35℃培养16 h，同法做正常血清对照，然后用暗视野显微镜观察活动的螺旋体数目，如实验标本中活动的螺旋体数目小于或等于对照血清标本内的40%，即为阳性。

（六）注意事项

（1）使用暗视野显微镜观察时，需注意：载玻片和盖玻片应清洁无污，载玻片宜薄，不超过1.2 mm；聚光器的高度应适当，以背景较暗、物像清晰为好；观察完毕后将集光器上的镜油擦净；进行镀银染色时，温度不宜太高，时间不宜太长，否则会影响染色结果；应多取组织液提高阳性率，但要尽量避免出血；取材后应立即观察，以免影响螺旋体的运动活力；注意观察梅毒螺旋体的形态及特有的运动姿态，以与其他螺旋体鉴别；暗视野未发现梅毒螺旋体，不能排除梅毒感染，应稍后复查或做血清学检查。

（2）RPR或TRUST试剂盒勿冰冻，于2～8℃保存，使用前恢复至室温；使用RPR抗原时应充分摇匀后垂直滴加；在规定时间内及时观察结果。本实验仅为初筛实验，阴性结果不能排除梅毒感染，阳性结果需进一步做梅毒螺旋体抗体实验确认。

（3）FTA-ABS荧光染色洗片时，每浸洗1次后，必须换液；每次实验均应同时设阳性、阴性及非特异性血清对照。

（4）ELISA血清标本应新鲜、无污染；加入试剂力求准确，一般用微量加样枪加样；反应板洗涤必须充分、彻底，以免影响判定结果；结果测定应以酶标仪读数为准。

（5）实验所用标本、试剂及废弃物应按生物危险品进行处理。

（6）由于各种梅毒血清学检测方法，并非都能在梅毒的不同病期检测出抗梅毒螺旋体抗体，为提高检出率，最好每次用2种以上的方法。

（7）TRUST是非特异性抗原实验，故实验阳性时，应注意排除生理性（孕妇可有0.4%假阳性）和急、慢性生物学假阳性的可能，如自身免疫性疾病（麻风、红斑狼疮、类风湿患者等）会出现假阳性。另外，某些疾病急性发病后（风疹、水痘、肺炎等）以及免疫接种后，也可出现暂时性假阳性。一般来说患者血清滴度在1∶8以上时梅毒的可能性大，低于1∶8时，应考虑到上述疾病的可能，并应用特异性实验加以证实。

（七）思考题

（1）简述梅毒螺旋体的临床意义。

（2）简述梅毒螺旋体的检验程序。

（3）简述梅毒螺旋体的血清学诊断方法。