五、步骤与方法

1.分离培养　培养是布鲁菌病诊断的金标准，在自动化连续监测血培养系统上，大部分布鲁菌一周内可监测到生长，其他临床标本可进行分离培养，划线接种需要在37℃、5%～10%CO2中孵育10天，若无菌生长，方可报为阴性。如为阳性，将细菌分区划线接种于血琼脂平板、MAC琼脂平板，置于35℃培养18～24 h，观察布鲁菌在血琼脂平板的生长特征，常规在血琼脂平板、巧克力琼脂平板、M-H琼脂平板和MAC琼脂平板均可生长。24～48 h可见菌落生长，布鲁菌形成较薄、常常融合在一起的菌落，如有单个菌落，直径1～2 mm，见图11-2及文后彩图。

2.涂片染色镜检

1）革兰染色　将马耳他布鲁菌进行革兰染色，显微镜下观察菌体形态及排列特征，革兰染色呈排列为细沙样阴性短小杆菌或球杆菌，菌体两端钝圆，见图11-3及文后彩图。

图11-2　马耳他布鲁菌在血琼脂平板上的菌落

图11-3　马耳他布鲁菌革兰染色形态

2）柯兹洛夫斯基（柯氏）染色法

（1）试剂Ⅰ：2%沙黄溶液。试剂Ⅱ：1%孔雀绿溶液。

（2）方法：①待检标本涂薄片，干燥，火焰固定；②滴加2%沙黄溶液，酒精灯加热至蒸汽出现；③流水冲洗，用1%孔雀绿溶液染色2～3 min。

（3）结果观察：布鲁菌染成淡红色，为球杆菌，其他细菌染成绿色或蓝色。

3.生化反应　该菌触酶阳性，氧化酶阳性，快速分解尿素，分解葡萄糖，不分解半乳糖。

尿素分解实验：

（1）原理：某些细菌具有尿素酶，可分解尿素产生大量氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变为红色。

（2）方法：无菌操作下将马耳他布鲁菌接种于尿素培养基中，35℃培养18～24 h。

（3）结果判断：培养基变为红色为阳性，不变色为阴性。

4.免疫学检查　由于布鲁菌培养的营养条件苛刻而且时间长，所以布鲁菌的血清学诊断越来越受到重视，血清学检查既可协助早期诊断，还可确定是否复发或重复感染。

1）虎红平板凝集实验

（1）原理：该实验又称班氏孟加拉平板凝集实验，主要根据抗原、抗体可在体外发生特异性结合并呈现可见反应的原理，用已知抗原检测未知抗体，该实验由于所用抗原为pH 3.5～3.9带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中IgM类抗体的凝集活性，检测IgG类抗体，因此提高了反应的特异性。

（2）方法：实验前，应将血清和抗原在室温放置30～60 min，将玻璃板上各格标记被检血清号，然后加相应被检血清30 μL，在被检血清旁滴加虎红平板凝集抗原30 μL，用牙签类小棒搅动血清和抗原，使之充分混合，在5 min内观察结果。每次实验应设阴性血清、阳性血清对照。

检测试剂使用R型犬种布鲁菌为天然粗糙型，所以产生的血清抗体为粗糙型布鲁菌血清抗体。在条件允许的情况下，建议虎红平板凝集抗原（检测S型布鲁菌抗体的虎红平板凝集抗原）和R型布鲁菌虎红平板凝集抗原同时进行检测。

图11-4　虎红平板凝集实验

（3）结果：观察到颗粒状凝集即为阳性，用于初筛，见图11-4。

2）试管凝集实验

（1）原理：特异性布鲁菌抗原可与倍比稀释的待检血清中抗体在体外发生特异的凝集反应，并可同时检测布鲁菌抗体的滴度。1897年，莱特等发现患布鲁菌病的患者血清与布鲁菌的培养物产生了凝集现象，该凝集反应又称莱特氏凝集。

（2）方法：①每份血清取6～8支小试管，放于试管架上。②血清稀释：第一管加入960 μL 0.5%石炭酸生理盐水，其余各管加入500 μL0.5%石炭酸生理盐水。第一管内加入备检血清40 μL，混匀后吸出500 μL血清稀释液加入第二管内，以此类推到最后一管，吸出500 μL血清稀释液弃去。③加入抗原：将试管凝集抗原充分混匀后，使用0.5%石炭酸生理盐水做10倍稀释。加入血清稀释液中，每管加入500 μL。④充分混匀后，放到37℃温箱内，20～22 h后取出，在室温下放置1～2 h，观察结果。

（3）结果：

①“++++”，液体完全透明，菌体呈伞状沉淀或块状颗粒状沉淀，呈100%凝集。

②“+++”，液体近于完全透明，菌体呈伞状沉淀，呈75%凝集。

③“++”，液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈50%凝集。

④“+”，液体不透明，管底有不明显的伞状沉淀，呈25%凝集。

⑤“-”，液体不透明，无伞状沉淀。

血清抗体效价1∶100及以上，判断为布鲁菌病抗体阳性，1∶50（++）为可疑。