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非结核分枝杆菌（non tuberculosis mycobacteria，NTM）：指结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。对酸、碱比较敏感，对常用的抗结核菌药物较耐受，生长温度不严格，多存在于环境中，为条件致病菌，可引起结核样病变，抗原与结核分枝杆菌有交叉。

（一）临床意义

非结核分枝杆菌广泛存在于自然界的土壤、尘埃、水、鱼类和家禽中，传播途径主要从环境中获得感染，近年来，因手术器械、注射器具及医疗用水等灭菌不合格、使用不规范造成了患者手术切口、注射部位非结核分枝杆菌感染暴发事件。由于非结核分枝杆菌的肺部感染在临床上难以与结核分枝杆菌的感染区别，而此类菌多数对常用抗菌药物和抗结核药物耐药，因此鉴别非结核分枝杆菌具有重要意义。

（二）非结核分枝杆菌检验程序

非结核分枝杆菌检验程序见图10-4。

（三）目的要求

（1）熟悉非结核分枝杆菌的检验程序。

（2）了解非结核分枝杆菌各群的形态特点。

（四）器材与试剂

1.菌种　非结核分枝杆菌、结核分枝杆菌。

2.培养基　罗氏培养基、对硝基苯甲酸培养基。

3.器材　干燥无菌的玻璃瓶、接种环、光学显微镜、荧光显微镜、洁净玻片、酒精灯等。

4.试剂　5%石炭酸复红染液、3%盐酸-乙醇溶液、碱性美蓝溶液、中性红溶液、纯蛋白衍生物（PPD）等。

（五）步骤与方法

1.标本采集　根据感染部位不同采取不同标本。对于肺部感染患者采取咳痰，最好是患者清晨第一口痰；对于淋巴结感染患者，通过细针针吸活检获取标本组织；对于脑脊液标本采集，以无菌要求做腰椎穿刺抽取脑脊液。

2.涂片镜检　标本可直接涂片，采用Ziehl-Neelsen抗酸染色法在油镜下镜检做初步诊断，也可用金胺O染色在荧光显微镜下观察，以提高阳性率。

1）Ziehl-Neelsen抗酸染色　原理、方法同结核分枝杆菌，镜下观察非结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细胞和细菌为蓝色。

2）金胺O染色　原理、方法同结核分枝杆菌，荧光显微镜下观察非结核分枝杆菌金胺O染色后呈亮黄色短棒状，其他细胞、细菌和背景为暗黄色。

3.分离培养　可将标本同时接种于罗氏培养基和含对硝基苯甲酸（PNB）的培养基。放入35℃恒温培养箱中培养，28天后观察结果。若仅于罗氏培养基生长，为结核分枝杆菌，若仅于对硝基苯甲酸培养基生长，则提示非结核分枝杆菌，需进一步鉴定。在BACTEC460系统培养基中加入5 μg/mL对硝基-α-乙酰氨基-β-羟基苯丙酮（NAP），可抑制结核分枝杆菌生长而不抑制非结核分枝杆菌生长。

4.非结核分枝杆菌的生物学特征　见表10-3。

5.生长特性鉴定实验　将经PNB培养基和生化特性鉴定实验初步鉴定为非结核分枝杆菌的培养菌落接种于罗氏培养基，置于28℃、37℃、42℃，观察生长时间、色素产生情况。按菌落色素与生长速度将非结核分枝杆菌分为以下4群。

1）光产色分枝杆菌（Runyon Ⅰ群）　菌落特点是在暗处一般不产生或仅产生少量色素，光照1 h后能在48 h内转为黄色或橘黄色，需要营养成分复杂，生长缓慢，菌落光滑，包括堪萨斯分枝杆菌和海分枝杆菌等。

2）暗产色分枝杆菌（Runyon Ⅱ群）　无论有光或无光均能产生色素，呈黄色或橘黄色，生长缓慢，菌落光滑，包括苏尔加分枝杆菌、戈登分枝杆菌等。

3）不产色分枝杆菌（Runyon Ⅲ群）　缺乏β-胡萝卜素，故在光照和暗处均不能产生色素，在40～42℃下生长慢，菌落光滑，包括鸟分枝杆菌复合群、溃疡分枝杆菌等。

4）快速生长分枝杆菌（Runyon Ⅳ群）　在普通培养基上即可生长，最适生长温度25～45℃，生长速度快，3～6天即可形成菌落，包括脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌和偶发分枝杆菌等。

6.抗煮沸实验　非结核分枝杆菌是否有致病性可用抗煮沸实验加以区分。非致病株煮沸1 min即失去抗酸性，而致病株能耐煮沸10 min，甚至高压蒸汽灭菌亦不能使之失去抗酸性。

7.药敏实验　许多非结核分枝杆菌对常见的抗结核药物耐药，如鸟-胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、龟-偶发分枝杆菌复合群、耻垢分枝杆菌等菌种对利福平、链霉素、异烟肼、乙胺丁醇、左氧氟沙星、莫西沙星、丙硫异烟胺均有较高的耐药性，且耐药性均在60%以上。因此在非结核分枝杆菌治疗前进行药敏实验，依据药敏结果调整用药方案的意义显得尤为重要。

（1）对于所有临床上重要的快速生长分枝杆菌如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌采用微量肉汤稀释法。取非结核分枝杆菌阳性培养物在MGITTM分枝杆菌快速生长指示管内进行二次传代，取第2周指数生长期菌液进行实验，以Middlebrook 7H9培养基稀释菌液至1 McF后，再100倍稀释至105 CFU/mL。将药物溶液用培养基倍比稀释至128 μL/mL、64 μL/mL、32 μL/mL、16 μL/mL、8 μL/mL、4 μL/mL、2 μL/mL、1 μL/mL，分别取100 μL依次加入96孔培养板中，再取100 μL菌悬液加入培养板中，使药物终浓度为64 μL/mL、32 μL/mL、16 μL/mL、8 μL/mL、4 μL/mL、2 μL/mL、1 μL/mL、0.5 μL/mL。每株细菌每种药设3排平行孔（菌液+药液），3个阳性对照孔（菌液）以及3个阴性对照孔（培养基）。完成后在37℃恒温箱中培育。报告结果时，参照美国临床和实验室标准协会CLSI-2012 M24-A的判断标准，将实验孔与阳性对照孔进行比对，以肉眼看不见细菌生长的最低药物浓度为MIC，记录MIC值。

（2）还可采用绝对浓度法，分别进行异烟肼（1、10 μg/mL）、利福平（50、250 μg/mL）、链霉素（10、100 μg/mL）、乙胺丁醇（5、50 μg/mL）、对氨基水杨酸（1、10 μg/mL）、阿米卡星（10、100 μg/mL）、对氨基水杨酸异烟肼（2、20 μg/mL）、卷曲霉素（10、100 μg/mL）、左氧氟沙星（5、50 μg/mL）、利福喷汀（5、250 μg/mL）、丙硫异烟胺（25、100 μg/mL）耐药性测定。接种后置于恒温箱37℃培养，4周后观察结果，同时以H37Rv药物敏感株作为质控菌株进行药敏实验。报告结果时以对照管菌落数超过200个且无融合为有效结果，药敏培养基上无细菌生长或菌落数少于20个视为敏感，超过20个菌落数视为耐药，质控菌株管应无细菌生长。

8.Mantoux皮肤实验　结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有共同抗原，虽然PPD皮试可产生交叉反应，但仍有区别之处。取结核分枝杆菌的PPD-T与非结核分枝杆菌的PPD-NTM同时进行皮肤实验，非结核分枝杆菌患者PPD-T硬结直径一般不超过15 mm。如PPD-NTM皮试硬结直径比PPD-T皮试硬结直径大5 mm或25%以上，即认为是非结核分枝杆菌感染。

9.分子生物学诊断

（1）多重PCR技术：在一个PCR反应体系中，依据MTB的MTP40基因序列（396 bp）、分枝杆菌属的32 Ka基因序列（506 bp）和MTB复合群（MTBC）的S6110序列分别设计3对特异性引物进行扩增，产生不同特异性靶区域片段，并且以MTB标准株H37Rv、牛分枝杆菌标准株、胞内分枝杆菌标准株作为阳性对照。经凝胶电泳观察，该技术可在1～2天内鉴别出结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。

（2）PCR-核酸测序：对特定的核苷酸靶序列进行序列分析。常用于鉴定非结核分枝杆菌的靶基因有HSP65、rpo B、16S-23S rRNA基因内转录间隔区序列等。

（3）PCR限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）：通过PCR扩增分枝杆菌染色体上一段DNA，将扩增产物经限制性内切酶消化，将消化的样本进行琼脂糖凝胶电泳分析，不同分枝杆菌酶切片段的数量或大小不同，电泳图谱呈现多态性。如利用PCR-RFLP对rpo B基因进行分析，扩增出的360 bp的rpo B基因经Hind Ⅱ、HaeⅢ、MvaⅠ和Acc Ⅱ酶切后进行片段分析，可以鉴别不同分枝杆菌复合群。

（4）PCR单链构象多态性分析（PCR-single strand conformation polymorphsim，PCR-SSCP）：PCR-SSCP技术可以区别至单个碱基突变，不同种的DNA单链其空间构象不同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率也不同，最终呈现不同的带谱。可通过设计两对引物分别扩增16S rDNA两条片段，根据SSCP电泳图谱与结核分枝杆菌标准株的相似性来鉴别NTM与MTB，并将该方法与细菌学鉴定进行对比，可以将MTB和NTM进行初步鉴定。

（六）注意事项

（1）非结核分枝杆菌亦有致病性，应注意生物安全。

（2）绝对浓度法药敏实验对接种量要求较严格，既要避免由于过量接种产生自然突变的可能，又要保证对照培养基上菌落生长旺盛。

（3）应用多重PCR时，要注意优化PCR反应条件。引物浓度、循环温度及时间是实验成败关键，应先进行预实验，确定最佳扩增条件。