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结核分枝杆菌（MTB）可通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径感染机体，可侵犯全身各器官，以肺结核常见。结核病（tuberculosis，TB）是全世界的第九大死因，在传染性疾病中排名第一，甚至超过艾滋病。2016年约有1040万例结核病新发病例，其中10%为HIV感染者，结核病患者死亡约有167万。近年来因自发突变或用药不当经突变选择而产生的耐药结核日益增多，2016年全球约有60万利福平耐药新发病例，其中有49万耐多药结核病患者，结核病已成为威胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题。

（二）结核分枝杆菌的检验程序

结核分枝杆菌的检验程序见图10-1。

（三）目的要求

（1）掌握结核分枝杆菌的形态学检查法及形态学特征。

（2）熟悉结核分枝杆菌的培养特性、常用鉴定方法。

（3）了解结核分枝杆菌检查方法的新进展。

（四）器材与试剂

1.菌种　卡介苗（BCG）、非结核分枝杆菌（耻垢分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌）。

2.培养基　罗氏（L-J）培养基。

3.试剂　4%NaOH溶液、Ziehl-Neelsen抗酸染液、金胺O染液、旧结核菌素（old tuberculin，OT）、结核菌素纯蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）等。

4.其他　接种环、载玻片、酒精灯、离心机、普通显微镜、荧光显微镜等。

（五）步骤与方法

1.标本采集　根据感染部位不同采取不同标本。例如，肺结核采取痰液，最好是患者清晨第一口痰；肾或膀胱结核以无菌导尿或取中段尿液；肠结核取粪便；结核性脑膜炎取脑脊液；脓胸、胸膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺脓汁或分泌物。

2.涂片镜检　标本可直接涂片染色。为提高检出率，对含菌量低的标本，应进行浓缩集菌：无其他杂菌污染的脑脊液、胸腔和腹腔积液等标本，可直接离心沉淀集菌。

1）Ziehl-Neelsen抗酸染色

（1）原理：分枝杆菌细胞壁含大量脂质，主要为分枝菌酸，不易着色，先用石炭酸复红染液初染，需经过加温和延长染色时间来促使其着色；但一旦细菌染上颜色，由于脂质的存在，即使强脱色剂也不能使之脱色，其他细菌均脱色；经碱性美蓝复染，结核分枝杆菌呈红色，其他呈蓝色。

（2）方法：用接种环挑取待检标本，涂布于载玻片上，加热固定。①初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加适量石炭酸复红染液覆盖标本区域，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时停止加热，若染液蒸发减少，应再补加染液，以免干涸，加热3～5 min，待标本冷却后用水冲洗。②脱色：3%盐酸-乙醇溶液脱色30 s～1 min，用水冲洗。③美蓝复染1 min，水洗、干燥、在油镜下镜检。

与上述经典热抗酸染液相比，Leagene抗酸染液（Kinyoun冷染法）属于冷染液，是滴加复红染液直接染色，无须加热，安全。在室温条件下，分枝菌酸与复红染液结合，经美蓝复染后，分枝杆菌仍为红色，其他非抗酸菌、细胞及背景为蓝色。

（3）结果：结核分枝杆菌呈红色，其他细菌与背景中的物质为蓝色（见图10-2）。

（1）原理：为荧光染液，无须加热，较抗酸染色安全。染色原理是在室温条件下金胺O染色及复染后，用含有紫外光源的荧光显微镜检查，抗酸菌呈亮黄色，而其他细菌及背景中的物质呈暗黄色，这种方法可用低倍镜镜检，可更快速找出抗酸菌。

（2）方法：用接种环挑取待检标本，涂布于载玻片上，加热固定。①初染：滴加金胺O染液避光染色10～15 min，水洗。②脱色：用3%盐酸-乙醇溶液脱色3～5 min，直至涂片无黄色为止，水洗。③复染：用0.5%高锰酸钾溶液染色2 min，水洗；轻轻吸干水分，自然干燥；在荧光显微镜下镜检。

（3）结果：结核分枝杆菌金胺O染色后呈亮黄色，其他细胞、细菌和背景为暗黄色。

涂片染色镜检结果应报告“找到抗酸杆菌或未找到抗酸杆菌”。具体报告方式见表10-1。

3.分离培养　脑脊液、胸腔积液、腹腔积液等无杂菌污染的标本可直接或离心沉淀后取沉渣接种。有杂菌的标本，如痰，可加1～2倍体积4%NaOH溶液涡旋振荡2～3次，室温静止15 min。1）方法　用取菌环取上述经消化处理的标本一环（约0.1 mL），均匀接种于L-J培养基斜面，每份标本接种2支培养基。将培养基斜面向上，于37℃培养箱5%～10%CO2孵育24 h后再直立于试管架上，继续培养至第8周。2）结果　一周之内生长菌落者为快速生长分枝杆菌；一周后生长者为慢速生长分枝杆菌。结核分枝杆菌为慢速生长分枝杆菌，在L-J培养基上的菌落呈乳白色或米黄色，菌落凸起，表面干燥、粗糙、颗粒状，形似菜花（见图10-3）。标本接种后应每天观察细菌生长情况，若发现可疑菌落，经涂片染色检查见抗酸杆菌，则随时报告“抗酸杆菌培养阳性”；培养8周未见菌落生长者，报告“分枝杆菌培养阴性”。培养阳性者应同时报告生长程度（见表10-2）。

（1）原理：人型结核分枝杆菌可产生大量烟酸，是牛型结核分枝杆菌和其他非结核分枝杆菌产生烟酸量的15～20倍。烟酸的浸出液中烟酸吡啶核环的氮与联苯胺乙醇液、溴化氰液作用时呈黄红色沉淀。

（2）方法：以热蒸馏水浸泡固体培养基上的培养物15～30 min，收集培养基的水浸液；将水浸液装入2支试管中，每管0.4 mL，再加入3%联苯胺乙醇溶液0.2 mL；向其中一管加入10%溴化氰溶液（此液剧毒，应在通风橱内操作）0.2 mL。

（3）结果：凡含10%溴化氰溶液的试管出现黄红色沉淀，另一管只产生无色沉淀者判为阳性；两支试管都产生无色沉淀者判为阴性。人型结核分枝杆菌烟酸实验阳性，而牛型分枝杆菌烟酸实验阴性。

2）硝酸盐还原实验

（1）原理：某些分枝杆菌产生硝酸盐还原酶，能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下与氨基苯磺胺、N-萘乙烯二胺盐酸盐作用生成红色的化合物N-α-萘胺偶氮苯磺酸。

（2）方法：取在L-J培养基上生长3～4周的菌落，称取10 mg菌落，量取1 mL生理盐水，制备成10 mg/mL菌悬液。取0.5 mL悬液加入2 mL硝酸盐溶液（85 mg NaNO3溶于100 mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液内，103.43 kPa灭菌20 min）中，置于37℃水浴2 h，取出后每管先加1滴二倍稀释的HCl，再加2滴0.2%氨基苯磺胺溶液和2滴0.1%的N-萘乙烯二胺盐酸盐溶液，1 min后观察结果。做此实验时，应以一支未接种细菌的培养基做对照实验，只有对照管阴性时，才能判定。

（3）结果：呈红色者为阳性，无色者为阴性，空白试剂对照为无色。人型结核分枝杆菌硝酸还原实验阳性，而牛型结核分枝杆菌硝酸还原实验阴性。

（1）原理：某些分枝杆菌具有耐高温的过氧化氢酶，经68℃加热依然保持其活性，催化过氧化氢成为水和氧，继而形成氧分子，出现气泡。

（2）方法：从L-J培养基上刮取菌落，称取5～10 mg菌落，量取1 mL生理盐水，配制5～10 mg/mL的菌液，分装于试管，每管0.5 mL；将该试管放入68℃水浴20 min；取出冷却至室温，沿试管壁缓缓加入30%过氧化氢（H2O2）溶液与10%吐温-80溶液的等量混合液0.5 mL（需新鲜配制），勿摇动。同时做堪萨斯分枝杆菌阳性对照和人型结核分枝杆菌阴性对照和空白试剂对照，于20 min内观察结果。

（3）结果：肉眼观察是否产生气泡，持续产生小气泡者为阳性，10～20 min内仍无气泡产生者为阴性，空白试剂对照无气泡产生。热触酶实验对区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有重要意义：人型结核分枝杆菌：触酶实验阳性、热触酶实验阴性。堪萨斯分枝杆菌：两种实验均阳性。

（1）原理：结核分枝杆菌含有的硫酸脑苷脂和硫酸多酰基化海藻糖可与中性红染料结合，产生中性红反应，以此可以鉴定结核分枝杆菌有无毒力。

（2）方法：①取可疑菌落数个，放在盛有5 mL 5%甲醇溶液的小试管中，37℃水浴加热1 h；②弃上清液，加5 mL 50%甲醇，37℃加热1 h；③弃上清液，再加新配制的碱性缓冲液（5%氯化钠，1%巴比妥钠）5 mL及中性红溶液0.2 mL，37℃水浴作用1 h；④每15 min振摇1次，观察结果。

（3）结果：中性红实验，如在黄色缓冲液中出现粉红色菌落者为阳性反应，非致病性结核分枝杆菌呈黄白色或不变色。

（1）原理：分枝杆菌是否有致病性可用抗煮沸实验加以区分。

（2）方法：将分枝杆菌标本置于100℃水中煮沸1～10 min，然后取标本涂片进行抗酸染色。

（3）结果：非致病株煮沸1 min即失去抗酸性，而致病株能耐煮沸10 min，甚至高压蒸汽灭菌亦不能使之失去抗酸性。

1）γ-IFN释放实验（interferon-γ gamma release assays，IGRAs）

（1）原理：对结核分枝杆菌致敏的T细胞，再次接受结核特异性抗原刺激后，活化的效应T细胞（包括CD4+和CD8+T细胞）能够产生γ-IFN。

（2）方法：酶联免疫斑点法（ELISPOT）：

①样本采集：用无菌注射器抽取患者外周静脉血5 mL，置入含肝素或EDTA抗凝采血管内。

②外周单个核细胞分离：取5 mL新鲜外周血（肝素或EDTA抗凝），加入等体积无菌RPMI 1640不完全培养液混匀，按稀释后血清∶LymphoprepTM分离液为2∶1加在LymphoprepTM分离液上层。注意不要与LymphoprepTM分离液混合，放入水平离心机，25℃，800 g离心15 min。

③外周血单个核细胞收集与计数：离心后，将形成云雾状的单个核细胞层，用吸管（或加样枪）将含外周血单个核细胞液体层转移到无菌15 mL尖底离心管，加入10 mLRPMI 1640（或者EZCultureTM无血清培养液）25℃，250 g离心10 min。小心弃去上层液体，将细胞沉淀重悬于1 mL EZ-CultureTM无血清培养液。将混匀的细胞悬液稀释后进行计数，根据计数结果用EZ-CultureTM无血清培养液调节细胞浓度为2.5×106/mL。

④每孔加入200 μL EZ-CultureTM无血清培养基或RPMI 1640培养基，室温静置5～10 min，倾去。

⑤按照实验安排：每个测试样本需4孔，每孔加入不同样本细胞100 μL。阴性对照：每孔加入10 μL EZ-CultureTM无血清培养基。阳性对照：每孔加入10 μL植物血凝素（PHA）。测试孔A：每孔加入10 μL结核分枝杆菌特异混合多肽A。测试孔B：每孔加入10 μL结核分枝杆菌特异混合多肽B。

⑥当加完所有的样本之后，盖上板盖，放入37℃、5%CO2培养箱培养16～20 h。

⑦裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基，每孔加去离子水200 μL，4℃冰箱放置10 min，低渗裂解细胞。

⑧洗板：倾倒孔内液体，每孔用200 μL 1×Washing buffer洗涤5次，每次30～60 s。最后一次，在吸水纸上扣干。

⑨检测抗体孵育：每孔加入100 μL稀释好的生物素标记的抗体，37℃孵育1 h。

⑩洗板：倾倒孔内液体，每孔用200 μL 1×Washing buffer洗涤5次，每次30～60 s。最后一次，在吸水纸上扣干。

⑪亲和素孵育：加入100 μL稀释好的酶标亲和素，37℃孵育1 h。

⑫洗板：倾倒孔内液体，每孔用200 μL 1×Washing buffer洗涤5次，每次30～60 s。最后一次，在吸水纸上扣干。

⑬显色：配好AEC显色液。每孔加入100 μL的显色液，室温避光静置15～45 min（在20～25℃，显色25 min较合适）。

⑭待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10～30 min，让膜自然晾干。勿将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。

⑮ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

（3）结果：当测试孔A和（或）测试孔B达到下列标准则判定为阳性结果：如果阴性对照孔斑点数为0～5，用测试孔A和（或）测试孔B的斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6；如果阴性对照孔斑点数≥6，测试孔A和（或）测试孔B的斑点数必须≥2倍阴性对照孔斑点数。如果上述标准不符合且质控对照孔检测阳性，则结果为阴性。

检验结果的解释：空白对照孔没有或斑点很少而阳性质控对照孔斑点数超过20个时被认为是正常结果；空白对照孔斑点数超过10个时结果被认为是“不确定”，建议重新检测；当阳性质控对照孔斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”，除非抗原A或抗原B孔根据结果解释和判断标准确定为阳性，此检测结果有效；基于生物学和反应体系的原因。当空白对照孔斑点数为0～5个且抗原A或抗原B斑点数减去空白对照孔斑点数等于5～7时，此结果被认为是“灰区”，应利用所有可利用的相关临床信息进行判断，必要时可进行复查。

2）结核菌素实验

（1）原理：结核菌素皮肤反应是迟发性超敏反应，当结核菌素PPD或OT注入皮内后，若受试者已感染结核分枝杆菌，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发性超敏反应炎症，若受试者未感染结核分枝杆菌则无反应。

（2）方法：取5单位结核菌素（0.1 mL）PPD或OT注射于左前臂掌侧前1/3中央皮内，并在48～72 h观察结果，看局部有无硬结，测量直径，如果不存在任何硬结，结果应记录为0 mm。

阴性（-）：硬结平均直径＜5 mm或无反应者为阴性，说明无结核感染。但应考虑以下情况：感染初期还未出现超敏反应；老年人、严重结核患者或正患有其他疾病，如麻疹、艾滋病导致的细胞免疫低下、肿瘤患者或用过免疫抑制剂者。

阳性（+）：硬结平均直径在5 mm或5 mm以上者为阳性，5～9 mm为一般阳性，10～15 mm为中度阳性，表明机体曾感染过结核分枝杆菌，出现超敏反应，但不表示正患结核。硬结平均直径≥15 mm或局部出现双圈、水疱、坏死及淋巴管炎者为强阳性，表明有可能有活动性结核，应进一步检查。

3）抗原检测　MTB抗原包括菌体细胞、PPD、脂阿拉伯甘露聚糖、14kD抗原、38kD抗原、31kD抗原、Ag85复合物、热休克蛋白65（heat shock proteins，HSP65）抗原、培养滤液蛋白10（culture filtrate protein，CFP-10）等。可通过酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫斑点实验（dot immunobinding assay，DIBA）、免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique，GITC）、免疫荧光技术（immunofluorescence）等，快速确定是否感染结核分枝杆菌。在机体产生致敏的T细胞或抗MTB抗体前即可检测到MTB的多种抗原成分，因此抗原检测是一类潜在的MTB感染的早期检测指标。结核抗原的检测可作为结核分枝杆菌存在的直接证据，可避免因免疫应答低下，导致抗体检测或细胞检测假阴性。

4）抗体检测　MTB的各种抗原成分可刺激机体产生多种特异性的抗MTB抗体，因此应用MTB抗原检测患者血清或其他体液中的抗MTB抗体也是结核病的辅助诊断方法之一。常用的MTB抗体检测方法包括结明实验（MycoDot）、ELISA、免疫斑点实验、斑点金免疫渗滤实验（DIGFA）、斑点免疫层析实验（dot immunochromatographic assay，DICA）、免疫印迹实验（westernblot）、蛋白芯片技术等。

6.分子生物学诊断

1）实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序及信号强弱变化来及时分析目的基因的拷贝数，通过与加入的已知定量标准品比较，实现荧光定量。qRT-PCR检测目的基因主要为MTB的IS6110基因，该片段基因只存在于人型、牛型等致病性MTB，且在人型MTB中重复10～20次。在检测过程中如绘制的曲线呈现较光滑的S形，结合Ct值可判断为阳性。

2）PCR限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）编码HSP65的基因广泛存在于所有分枝杆菌中，具有高度保守性，通过分枝杆菌属特异性引物对标本中HSP65基因进行扩增，再通过不同的限制性内切酶（如BstE Ⅱ和HaeⅢ）消化扩增的DNA产物，得到不同的酶切图谱，根据酶切图谱的特点鉴定分枝杆菌菌种。

3）16S rRNA基因序列测定　由于结核分枝杆菌的16S rRNA基因序列高度保守，具有种特异性，可通过测定16S rRNA基因序列来鉴定结核分枝杆菌。

7.药物敏感实验

结核分枝杆菌体外药敏实验的常见方法有以下五种：仪器法、琼脂比例法、绝对浓度法、耐药率法、E实验。

1）仪器法　仪器检测系统有BACTEC 460TB、BACTEC MGIT 960、MB/BacT Alert 3D、ESP结核分枝杆菌检测系统。将细菌同时接种于含药的液体培养基和无药管，然后通过比较两管中细菌生长代谢产生的CO2的比例和数量来确定细菌的耐药性。其中BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌快速培养仪是集分枝杆菌快速培养、检测及药敏技术为一体的全自动分枝杆菌培养系统。该系统采用检测荧光的方法来检测CO2，荧光强度记忆检测器每隔60 min测定培养管内荧光强度，以生长指数GI值报告结果。

2）琼脂比例法　将纯培养物菌悬液接种于含药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组。经过培养，当含有药物的培养基上菌落数目大于对照菌落数的1%，则判为耐药，若超过对照组的75%以上，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长或菌落数不大于对照格菌落数的1%则为敏感。一旦任何一线药物出现耐药，应检测二线药物。

3）绝对浓度法　将定量的细菌接种于一个无药对照培养基和几个梯度药物浓度的培养基，能够抑制所有或几乎所有的细菌生长的最低药物浓度，即为此药物的最小抑菌浓度（MIC）。

4）耐药率法　将受试菌和标准实验室菌株进行耐药率的比较。2株细菌平行实验，在含有连续倍比稀释药物浓度的培养基上接种定量的细菌，耐药率以受试菌的MIC与标准的MIC比率表示。

5）E实验　是一种改良琼脂扩散实验，其原理是将药物以log2梯度稀释成不同浓度，并用特殊技术固定于特制的塑料条（5 mm×50 mm）上，然后将药条贴于处理过的含MTB的改良培养板表面并观察其抑菌圈。这是一种定量检测的方法，操作简便，结果准确、快速，且可用于联合药敏实验，易于标准化操作和进行质控，但该方法成本较昂贵，易受到其他因素影响，阴性率与假阳性率较高。

此外，近年来还出现噬菌体生物扩增法和刃天青显色法等方法。

（六）注意事项

1.细菌标本片的制备　细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。固定时火焰不宜温度过高，以免破坏菌体结构。

2.抗酸染色　抗酸染色初染加热时，勿使染液煮沸或煮干，应随时补充染液以防干涸；染色完毕，可用吸水纸吸干载玻片上的水分，切记不要用吸水纸擦载玻片；用过的吸水纸上可能沾有染色的结核分枝杆菌，故不宜再用于吸干第二份标本，以免发生错误诊断。

3.细菌接种　接种标本于L-J斜面培养基后，应反复倾斜培养基，使标本均匀分布于培养基表面。为防止结核分枝杆菌引起医源性传播，所有涉及标本的涂片、接种、生化实验等操作均应在生物安全柜中进行；接种环用后应先放入沸水中灭菌1 min，再于火焰中烧灼，不可直接在火焰上灼烧，以防止环上菌液骤热形成气溶胶造成实验室污染。

4.痰标本处理　痰标本在培养前进行处理时，不可随意提高试剂的浓度或延长处理时间，以防止杀伤大多数结核分枝杆菌。经酸、碱处理的标本不宜进行荧光染色，荧光染色后的涂片应在24 h内检查。

5.金胺O染色　荧光易衰减，尽量避光操作，每次使用后盖紧试剂瓶，以防试剂挥发和污染，试剂有刺激性，注意适当防护。

6.γ-IFN释放实验　每份样本的测定必须同时设置阴性和阳性对照，并且加样枪枪头或自动洗板器不要接触到微孔板内PVDF膜。枪头或洗板器造成的压痕或缺口产生假象可能导致结果误判。

7.结核菌素实验　配制的稀释液放于有色瓶中，避免日光直晒，4℃可保存2周。玻璃及塑料对结核菌素有明显吸附作用，抽取后务必于1 h内用完，否则效价降低影响效果。

8.其他　PCR操作中需注意实验器材的污染问题，以免出现假阳性。

（1）如何降低痰标本抗酸染色检查的假阳性、假阴性结果？

（2）γ-IFN释放实验中为什么每份样本的测定必须设置阳性、阴性对照？