一、蜡样芽孢杆菌

（一）临床意义

蜡样芽孢杆菌引起人类感染的病例主要是食源性疾病，也可引起机会性感染。由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒可分为两种类型：腹泻型，由一种不耐热的肠毒素复合物引起，其特征是在摄入污染食物8～16 h后，出现腹痛，伴随腹泻；呕吐型，由耐热的肠毒素引起，其特征是在食用污染食物（主要是米饭）1～5 h后，出现恶心、呕吐症状。由蜡样芽孢杆菌引起的眼内炎是一种严重的病症，可造成眼穿透性损伤甚至可导致血源性扩散，且进展得非常迅速。蜡样芽孢杆菌还可引起其他部位的感染，严重伤感染会致命。

（二）蜡样芽孢杆菌检验程序

蜡样芽孢杆菌检验程序见图9-1。

图9-1　蜡样芽孢杆菌检验程序

（三）目的要求

（1）熟悉蜡样芽孢杆菌形态染色特点、菌落特点、常用生化反应及鉴定实验、活菌计数法。

（2）了解蜡样芽孢杆菌肠毒素测定方法。

（四）器材与试剂

1.菌种　蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌。

2.培养基　营养琼脂平板、血琼脂平板、卵黄琼脂平板、葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、水杨苷、乳糖、甘露醇、木糖等糖发酵管，蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基、明胶培养基等。

3.试剂　吲哚试剂、V-P试剂、鞭毛染液、3%过氧化氢溶液等。

（五）步骤与方法

1.形态观察　革兰阳性大杆菌，两端稍钝圆，单个或链状排列，芽孢椭圆形，位于菌体中央或次极端，不使菌体膨胀。有周鞭毛，无荚膜。

2.菌落观察　在营养琼脂平板上形成直径4～6 mm、灰白色、不透明、圆形凸起、边缘常呈扩展状、迎光呈白蜡状的菌落；血琼脂平板上菌落呈浅灰色似毛玻璃状外观，菌落周围形成β溶血环；卵黄琼脂平板上由于产生卵磷脂酶分解培养基中的卵磷脂，菌落周围形成乳白色混浊环。

3.生化反应　该菌触酶、卵磷脂酶和DNA酶均为阳性，能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，水解水杨苷产酸不产气，液化明胶，利用枸橼酸盐，V-P实验阳性，不分解乳糖、木糖、甘露醇，硫化氢实验阴性，不产生吲哚。

4.乳光反应

（1）原理：蜡样芽孢杆菌能产生卵磷脂酶，在有Ca2+存在时，能迅速分解培养基中卵磷脂，产生甘油酯和水溶性磷脂胆碱，故在菌落周围出现乳白色混浊环，称乳光反应或卵黄反应。

（2）方法：用接种针挑去可疑菌落点种在10%卵黄琼脂平板上，35℃孵育3 h即可观察结果。

（3）结果及意义：孵育3 h虽无菌落生长，但在点种处可出现乳白色混浊环，6 h后混浊环直径可扩大至5～6 mm。可用于测定细菌能否产生卵磷脂酶，也可以此做活菌计数。

5.活菌计数　将可疑食物标本用无菌生理盐水稀释成10-1、10-2、10-3 g/mL等不同浓度的稀释液。

（1）乳光反应计数法：取各稀释度的悬液0.1 mL分别接种于卵黄琼脂平板上，用L形玻璃棒涂布均匀，35℃孵育6 h，观察结果，本菌在此平板上产生乳光反应，易于识别和计数。

（2）倾注平板计数法：方法及结果记录见第二章实验一相关内容，一般认为每毫升或每克食物中蜡样芽孢杆菌的活菌数大于105时，即有发生食物中毒的可能。

（六）注意事项

（1）蜡样芽孢杆菌在20～40℃、pH 4.0～9.3条件下，污染食品后可迅速繁殖，并产生大量肠毒素，进食后可引起食物中毒。

（2）因暴露于空气中的食品在一定程度上受到蜡样芽孢杆菌的污染，故不能因分离出本菌就认为是引起食物中毒的病原菌。一般认为，蜡样芽孢杆菌数为105CFU/g（或105CFU/mL）有发生食物中毒的可能性。

（3）对蜡样芽孢杆菌引起食物中毒的细菌学检验，除分离鉴定细菌及活菌计数外，必要时还应进行肠毒素测定。

（七）思考题

（1）甘露醇-卵黄-多黏菌素琼脂平板培养基在分离蜡样芽孢杆菌时，各组成成分对于蜡样芽孢杆菌分离所起作用有哪些？

（2）蜡样芽孢杆菌鉴定要点有哪些？