一、弧菌属

（一）临床意义

弧菌属细菌主要分布于海水或河水中，与人类感染有关的有12种。其中霍乱弧菌引起烈性肠道传染病霍乱。副溶血弧菌主要引起食物中毒，常因烹饪不当的海产品或盐腌制品传播。因食物容器或砧板生熟不分污染本菌后，也可导致食物中毒。除可引起肠道感染外，某些情况下弧菌属细菌还可引起伤口感染、菌血症等肠道外感染。肠道外感染常与外伤暴露于海水或河水有关。

（二）弧菌属的检验程序

弧菌属检验程序见图8-1。

图8-1　弧菌属检验程序

（三）目的要求

（1）掌握霍乱弧菌和副溶血弧菌在常用选择性培养基上的菌落特征、涂片染色镜下形态和主要生化鉴定实验。

（2）熟悉弧菌属检验程序。

（3）了解霍乱弧菌的血清学实验和生物分型实验。

（四）器材与试剂

1.菌种　霍乱弧菌和副溶血弧菌。

2.培养基　碱性蛋白胨水（pH 8.5）、碱性琼脂平板、硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂平板、4号琼脂平板、嗜盐性选择平板、血琼脂平板、我妻血琼脂平板、弧菌显色培养基、MIU培养基、SS琼脂平板、肉汤、含盐肉汤（0%、3%、7%、10%NaCl）、赖氨酸脱羧酶培养基、鸟氨酸脱羧酶培养基、精氨酸双水解酶培养基、氨基酸对照培养基等。

3.试剂　O1及O139群诊断血清、5%红细胞悬液、氧化酶试剂、吲哚试剂、5 g/L去氧胆酸钠溶液、革兰染液、浓硫酸、无菌液体石蜡、蒸馏水。

4.其他　弧菌抑制剂O/129（2，4-二氨基-6，7-二异丙基蝶啶磷酸盐）药敏纸片（10 μg/片及150 μg/片）、多黏菌素B药敏纸片等。

（五）步骤与方法

1.分离培养　将霍乱弧菌接种在pH 8.5碱性蛋白胨水、4号琼脂平板、TCBS琼脂平板、碱性琼脂平板、弧菌显色培养基上，将副溶血弧菌接种在TCBS琼脂平板、嗜盐性选择平板和SS琼脂平板、弧菌显色培养基上，35℃培养18～24 h，观察细菌生长状况。弧菌属细菌在各种培养基上可有多种不同的菌落形态，可为光滑、粗糙、凸起、扁平状等，菌落形态多样。霍乱弧菌及副溶血弧菌在各种培养基上的菌落形态见表8-1。

表8-1　霍乱弧菌及副溶血弧菌在各种培养基上的菌落形态

2.涂片染色镜检

（1）挑取霍乱弧菌、副溶血弧菌菌落，涂片、革兰染色，油镜下可见革兰阴性杆菌，形态直或微弯。霍乱弧菌常为弧形或逗点状，呈不规则排列。副溶血弧菌可为弧形、卵圆形、棒状等形态。

（2）动力和制动实验：取霍乱患者临床标本，制成悬滴或压滴标本，直接在暗视野或相差显微镜下观察可见流星样快速穿梭运动的细菌。在涂片的悬滴或压滴中加入1滴效价高于1∶64的霍乱多价诊断血清（O1抗体和O139抗体），如见快速运动的细菌运动停止，为制动实验阳性。可初步判断为霍乱弧菌。

3.生化反应

弧菌属细菌氧化酶实验阳性，可以发酵葡萄糖，大部分细菌不产气（弗尼斯弧菌除外）。弧菌属细菌有鞭毛，动力实验阳性。霍乱弧菌和副溶血弧菌吲哚实验阳性，霍乱弧菌脲酶实验阴性，副溶血弧菌脲酶实验可为阴性或阳性。氨基酸脱羧酶实验及精氨酸双水解酶实验是病原性弧菌的主要生化鉴定实验，霍乱弧菌、副溶血弧菌赖氨酸及鸟氨酸脱羧酶实验阳性，霍乱弧菌、副溶血弧菌精氨酸双水解酶实验阴性。霍乱弧菌及副溶血弧菌主要生化反应见表8-2。

表8-2　霍乱弧菌及副溶血弧菌主要生化反应

注：A表示酸；K表示碱。

除以上生化反应外，弧菌属细菌的其他鉴定实验如下。

1）霍乱红实验

（1）原理：弧菌属细菌有色氨酸酶，可分解碱性蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚。该属细菌同时有硝酸盐还原能力，可将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐。吲哚与亚硝酸盐可反应生成结合产物亚硝酸吲哚，后者遇浓硫酸后呈玫瑰红色，即为霍乱红实验阳性。

（2）方法：无菌操作条件下，将待检细菌接种于含硝酸盐的碱性蛋白胨水中，35℃培养18～24 h，观察结果。

（3）结果判断：在观察实验结果前，在碱性蛋白胨水培养基中加数滴浓硫酸，混合后，出现玫瑰红色为实验阳性。弧菌属此实验阳性。

2）黏丝实验

（1）原理：霍乱弧菌菌落与5 g/L去氧胆酸钠溶液混匀成浓厚菌悬液，约1 min，混浊的菌悬液逐渐变清，质地变得黏稠，用接种环挑取时可产生拉丝现象，即为黏丝实验阳性。

（2）方法：挑取霍乱弧菌菌落加入5 g/L去氧胆酸钠溶液中，制成浓厚的菌悬液。大约1 min后，用接种环挑取菌悬液，观察有无拉丝现象。

（3）结果判断：1 min后观察菌悬液由混浊逐渐变清，用接种环挑取菌悬液，出现拉丝现象，即为实验阳性。弧菌属细菌除个别菌株外，绝大部分实验阳性。

3）神奈川现象（Kanagawa phenomenon，KP）实验

（1）原理：副溶血弧菌在普通血琼脂平板上不溶血或产生α溶血，在我妻血琼脂平板上产生β溶血。

（2）方法：用接种环挑取副溶血弧菌菌液，在我妻血琼脂平板表面涂布约1 cm直径的圆圈，35℃培养18～24 h，观察有无溶血现象。

（3）结果判断：在我妻血琼脂平板上出现透明溶血环（β溶血），为神奈川现象实验阳性。95%的副溶血弧菌菌株本实验阳性。

4）耐盐实验

（1）原理：不同细菌在生长时，对NaCl的耐受浓度不同，可据此对细菌加以鉴别。

（2）方法：将待检细菌分别接种于不同浓度（0%、3%、7%、10%）的NaCl肉汤中，35℃培养18～24 h，观察细菌生长情况。

（3）结果判断：观察细菌在不同浓度NaCl蛋白胨水中的生长情况，判断其对NaCl的耐受情况。霍乱弧菌可在0%NaCl和3%NaCl肉汤中生长，高于6%的NaCl浓度则不能生长。副溶血弧菌可在3%、7%的NaCl蛋白胨水中生长，在0%NaCl和10%NaCl肉汤中不生长。

5）血清学实验

（1）原理：霍乱弧菌可与O1及O139群诊断血清中相应的抗体发生凝集，借此可将霍乱弧菌分为O1或O139群。不同型的O1群霍乱弧菌可与小川型、稻叶型单价诊断血清中的抗体发生凝集，借此可将O1群霍乱弧菌分型。

（2）方法：取待检霍乱弧菌与霍乱O1及O139群诊断血清做玻片凝集实验，进行分群。将O1群霍乱弧菌分别与小川型、稻叶型单价诊断血清进行玻片凝集实验，进行分型。

（3）结果判断：分群实验中若待检细菌在诊断血清中10 s内出现肉眼可见的凝集，且在生理盐水中不凝集，则为霍乱弧菌O1或O139群。分型实验中与小川型单价诊断血清凝集，但与稻叶型单价诊断血清不凝集者为小川型；与稻叶型单价诊断血清凝集，但与小川型单价诊断血清不凝集者为稻叶型；与小川型及稻叶型单价诊断血清均出现凝集者为彦岛型。

6）多黏菌素B敏感实验

（1）原理：O1群霍乱弧菌可分为古典生物型和El-Tor生物型。对多黏菌素B敏感度不同。

（2）方法：将O1群霍乱弧菌涂布接种于M-H药敏平板上，待平板干后在中心位置贴上多黏菌素B药敏纸片，35℃，18～24 h，观察结果。

（3）结果判断：抑菌圈直径≥10 mm，为敏感。抑菌圈直径≤7 mm，为耐药。古典生物型对多黏菌素B敏感，El-Tor生物型对多黏菌素B耐药。

7）溶血实验

（1）原理：多数El-Tor生物型霍乱弧菌可使绵羊红细胞发生溶血，古典生物型霍乱弧菌不能使绵羊红细胞发生溶血。

（2）方法：取待检细菌24 h肉汤培养物1 mL，与5%绵羊红细胞悬液1 mL混匀，35℃水浴2 h，观察结果。

（3）结果判断：50%红细胞被溶解为溶血实验阳性。古典生物型阴性，多数El-Tor生物型阳性。

8）O/129敏感实验　弧菌属对10 μg/片及150 μg/片的O/129均敏感。

（六）注意事项

（1）对疑为霍乱患者的标本，检测需在二级以上生物安全防护等级的实验室中进行，在检测过程中一定要严格遵守操作规程，避免自身感染和污染实验室。

（2）细菌接种于含蔗糖的TCBS平板上孵育时间超过24 h或者孵育后冷藏，TCBS平板上的黄色菌落可转为绿色。

（3）玻片凝集法做霍乱分群、分型实验时，如凝集现象不典型需做试管凝集实验进一步确认。

（4）细菌发酵培养基中的糖产酸，当pH降低时，氧化酶实验可出现假阴性。因此，挑取TCBS平板上的菌落做氧化酶实验，结果不可靠。应挑取不含糖培养基上的菌落做氧化酶实验。

（5）O1群霍乱弧菌溶血实验35℃水浴2 h如不溶血，需4℃过夜后观察。

（七）思考题

（1）霍乱弧菌与副溶血弧菌主要的鉴别实验有哪些？

（2）霍乱弧菌分为几群和几型？用哪些实验进行分群和分型？