一、铜绿假单胞菌

（一）临床意义

铜绿假单胞菌广泛存在于环境以及正常人体肠道、皮肤及外耳道，当宿主黏膜屏障受损或免疫力低下时，则会引起感染，包括烧伤或创伤部位的皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、眼部感染、中耳炎等，还可引起脓胸、脑膜炎、败血症，严重者可导致死亡。

（二）检验程序

铜绿假单胞菌检验程序见图7-1。脓汁、分泌物、痰、尿、胸（腹）腔积液标本可直接或离心后涂片染色，然后接种血琼脂平板、MAC琼脂平板进行分离培养。脑脊液、血液标本经增菌培养后，再进行分离培养。

（三）目的要求

（1）掌握铜绿假单胞菌的镜下形态、菌落特征和主要生化反应。

（2）熟悉铜绿假单胞菌的检验程序。

（四）器材与试剂

1.标本　铜绿假单胞菌或铜绿假单胞菌和葡萄球菌（或其他菌）的混合模拟标本。

图7-1　铜绿假单胞菌检验程序

2.培养基　血琼脂平板、MAC琼脂平板、KIA培养基、非发酵细菌编码鉴定系列生化管（或MIU、O/F（葡萄糖、麦芽糖、木糖）、硝酸盐、精氨酸双水解酶、枸橼酸盐、赖氨酸脱羧酶微量生化管）等。

3.试剂　革兰染液、氧化酶试剂或纸片、3%过氧化氢溶液、硝酸盐还原试剂、吲哚试剂等。

4.其他　无菌生理盐水、无菌液体石蜡、玻片、恒温孵育箱等。

（五）步骤与方法

1.分离培养　将铜绿假单胞菌或模拟标本分区划线接种于血琼脂平板和MAC琼脂平板，35℃培养18～24 h，观察菌落特征。铜绿假单胞菌在血琼脂平板上形成边缘不规则、灰绿色、有金属光泽菌落，菌落周围有透明溶血环。在MAC琼脂平板上形成大小不一、黄绿色或半透明的菌落，48 h后菌落中央常呈棕绿色。

2.涂片染色镜检　挑取疑似铜绿假单胞菌的菌落，革兰染色，在显微镜下观察：可见革兰阴性杆菌，菌体长短不一。

3.生化反应

（1）挑取疑似菌落接种于KIA培养基，35℃培养18～24 h。观察生长现象，结果应为K/K--。此步骤既可作为标本的纯培养，也可作为细菌的生化鉴定。

（2）从KIA斜面上取菌，做氧化酶实验，同时接种于O/F、硝酸盐等系列生化培养基，35℃培养18～24 h观察结果，见表7-1。最终根据全面生化反应鉴定。

（3）根据实验室条件可以用全自动微生物鉴定仪鉴定，也可接种于非发酵细菌编码鉴定系列生化管中，35℃培养18～24 h，观察判断生化反应结果。根据实验结果的数码组合，查编码表，即可得到鉴定结果。

表7-1　铜绿假单胞菌主要生化反应结果

注：O表示氧化型。

（六）注意事项

（1）绿脓菌素是铜绿假单胞菌鉴定的重要依据，但是并不是所有菌株都产生色素；菌落特征与多种因素有关，有的痰标本培养后会形成黏液型菌落，所以，在挑取可疑菌落时要多方面考虑。

（2）在进行生化编码鉴定时，任何一项生化反应的错误，都会导致编码的改变，因此，在保证接种上该菌的同时，应注意无菌操作，避免出现假阳性结果。

（七）思考题

（1）铜绿假单胞菌和大肠埃希菌在血琼脂平板上的生长现象有何不同？

（2）铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌的主要鉴别依据是什么？