五、综合性实验：肠杆菌科细菌的分离鉴定

（一）临床意义

临床标本中常见的肠杆菌科细菌包括埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、变形杆菌属等，它们的形态及在普通培养基上的生长情况无鉴别意义。通常是根据各菌在鉴别或选择培养基上的菌落特点及生化反应等进行初步鉴定，然后，再根据各类菌的抗原特异性血清学实验进行型别鉴定，必要时开展毒素鉴定和药敏实验。

肠杆菌科细菌中致病性大肠埃希菌、志贺菌属、沙门菌属常经外源性感染途径侵入肠道，引起肠道病理改变，主要表现为腹泻，病原体随粪便排出，粪便标本的分离培养鉴定有助于肠道感染性疾病的病原学诊断，本章综合性实验主要探讨粪便中致病性肠杆菌科细菌的分离鉴定。

（二）粪便标本中肠杆菌科细菌的检验程序

粪便标本中肠杆菌科细菌的检验程序见图6-5。

图6-5　粪便标本中肠杆菌科细菌的检验程序

（三）目的要求

（1）掌握粪便标本常见肠杆菌科细菌的鉴定依据。

（2）熟悉粪便标本中肠杆菌科细菌分离鉴定程序。

（四）器材与试剂

1.培养基　亚硒酸盐增菌培养基、GN增菌培养基、卡-布（Cary-Blair）运送培养基、Mueller连四硫酸盐（TTBB）肉汤；SS琼脂平板、EMB琼脂平板、MAC琼脂平板、中国蓝琼脂平板、木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂（XLD）、普通琼脂平板等。

2.器具　恒温箱、酒精灯、无菌棉拭子、取菌环、接种针、载玻片、盖玻片、显微镜等。

3.染液　革兰染液。

4.其他　肠道杆菌生化反应管（单糖发酵、靛基质、甲基红、V-P、枸橼酸盐、硝酸盐、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、尿素酶、氧化酶等），梅里埃API20E肠道菌鉴定试剂条及配套试剂（可选），埃希菌属多价、沙门菌属A-F多价O、志贺菌属四群多价诊断血清，生理盐水，药敏纸片等。

（五）步骤与方法

1.增菌培养　肛拭标本接种增菌培养基，37℃培养18～24 h，观察结果，若液体培养基呈混浊或液面有菌膜或管底有絮状沉淀，表明增菌成功。粪便标本一般不需要增菌，可直接从步骤2开始。

2.分离培养　接种环挑取新鲜粪便标本，划线接种于EMB或SS琼脂平板上，37℃培养24 h。

3.观察菌落特征　观察平板上菌落的大小、颜色、透明度等特点，初步识别可疑病原菌菌落，进行鉴定。在EMB琼脂平板上非致病菌菌落较大、紫黑色、有金属光泽、不透明，而可疑病原菌菌落略小、半透明。在SS或MAC琼脂平板上非致病菌菌落较大、红色、不透明，而可疑病原菌小而透明或半透明。具体见表6-2。

表6-2　致病性肠道杆菌在SS/MAC和EMB琼脂平板培养结果

续表

4.染色镜检　挑取选择性培养基上可疑菌落进行革兰染色镜检，肠杆菌科细菌革兰染色阴性，菌体短小，宽0.5～2.0 μm，长0.7～5.0 μm。

5.生化反应鉴定

（1）可疑菌落中心点取细菌，以接种针穿刺接种克氏双糖铁（KIA）培养基或三糖铁培养基，37℃培养18～24 h后，观察结果，并据此判定细菌属性，见表6-3。

（2）氧化酶实验：用无菌滤纸条蘸取可疑菌落少许，滴加氧化酶试剂1滴，阳性者立即呈现粉红色或红色。

（3）可疑菌落接种生化反应管，包括葡萄糖发酵、乳糖发酵、麦芽糖发酵、甘露醇发酵、蔗糖发酵、靛基质、甲基红、V-P、枸橼酸盐、硝酸盐、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、尿素酶等。

（4）挑取可疑菌落于5 mL生理盐水中制成一定浓度的菌悬液，按梅里埃API20E肠道菌鉴定试剂条使用说明接种于试剂条上，培养后根据生化反应结果进行判断。

6.血清学鉴定　根据初步鉴定结果，选用相应细菌的诊断血清做玻片凝集实验。用接种环自KIA培养基斜面上挑取少许菌苔，分别磨匀于生理盐水与相应细菌多价诊断血清中，摇动玻片1～2 min，观察结果，同时用生理盐水代替血清做自身凝集对照，凝集实验阳性者出现凝集块，再进一步与相应单因子血清做凝集实验。

表6-3　KIA培养基生化反应鉴定

注：⊕表示产酸产气；+表示产酸不产气（葡萄糖、乳糖实验），+表示阳性（硫化氢、动力实验）；-表示阴性；+/-表示多数阳性，少数阴性；-/+表示多数阴性，少数阳性。

7.毒力检测

1）ETEC不耐热肠毒素和耐热肠毒素检测

（1）兔肠段结扎实验：将待检可疑菌株接种Honda's产毒肉汤，35℃培养24 h，3000 r/min离心30 min，取上清液用滤器过滤。如检测耐热肠毒素，则还需于60℃加热30 min，取2 kg左右的健康家兔，禁食后麻醉剖腹取出小肠，自回肠末端开始结扎，每段5 cm，共6段，其中两段分别设为阳性对照和阴性对照，其余四段注入待测毒素液1 mL，再放回小肠，缝合腹壁，18 h后剖腹检查，抽取各段内积液测定容量，并测定肠段长度，积液量与肠段长度之比大于或等于1 mL/cm3者为阳性。

（2）乳鼠灌胃法：本法用于检测耐热肠毒素。肠毒素液的制备同上。将待测肠毒素液0.1 mL用塑料小管注入1～4日龄的乳鼠胃内，禁食3～4 h后用氯仿麻醉，取出全部肠管，称肠管和积液的重量及剩余的体重，肠管重量和剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～0.08之间为可疑。

2）志贺菌侵袭力检测：采用豚鼠角膜结膜炎实验。制备可疑菌菌悬液（培养18 h），用灭菌大头针在体重300～400 g的健康豚鼠角膜上轻轻划数下，在划伤处接种待检细菌菌悬液50 μL，若次日无任何反应，再接种50 μL，接种后在光线明亮处观察，于接种后的次日、急性初期、恢复初期和末期自结膜囊处分离细菌，并鉴定与原接种菌是否一致。经过1～2天的潜伏期，最初表现为结膜充血水肿，角膜出现白点，眼内出现泪液或浆液性分泌物。以后症状逐渐加重，出现结膜高度水肿，角膜由浅灰色变为毛玻璃状甚至呈乳白色。睑缘有多量浆液脓性分泌物，甚至可使眼裂封闭。发病5～6天后可见自角膜边缘出现的紫红色圆环，边缘齐，表面稍高起。红环逐渐向角膜中心扩展，经一周后将瞳孔遮蔽，此时角膜外观呈牛肉色，以后进入恢复期，有些实验动物的症状逐渐恢复，但有些实验动物的症状持续呈慢性。

（六）思考题

（1）肠道杆菌有何共同特征？

（2）大肠埃希菌、变形杆菌、志贺菌、伤寒沙门菌及乙型副伤寒沙门菌的鉴别要点是什么？

（3）如果大肠埃希菌、伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和志贺菌混杂在肉汤培养基中，如何把它们分离出来，并得到各种细菌的纯培养物？

（李秀真）