一、大肠埃希菌

（一）临床意义

大肠埃希菌是肠杆菌科细菌的重要成员，为条件致病菌，常引起多种肠外感染，如泌尿系统感染、胆囊炎、手术伤口感染、腹膜炎等。致病性的大肠埃希菌可引起肠道内感染。

（二）大肠埃希菌的检验程序

大肠埃希菌的检验程序见图6-1。

图6-1　大肠埃希菌的检验程序

（三）目的要求

（1）掌握大肠埃希菌的形态、染色特点、培养特性、生化反应、常见类型及鉴定依据。

（2）熟悉大肠埃希菌的血清学鉴定。

（四）器材与试剂

（1）菌种：普通大肠埃希菌、致病性大肠埃希菌（EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC）。

（2）培养基：克氏双糖铁（KIA）培养基、动力-吲哚-尿素（MIU）培养基、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐琼脂斜面、硝酸盐培养基、SS琼脂培养基、MAC琼脂培养基或SMAC琼脂培养基。

（3）试剂：EPEC多价诊断血清、单价诊断血清、EIEC OK多价Ⅰ、Ⅱ两组诊断血清和单价诊断血清、氧化酶试剂、甲基红试剂、40%KOH溶液、3%过氧化氢溶液、革兰染液。

（五）步骤与方法

1.分离培养　取普通大肠埃希菌及EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC分别接种在SS琼脂平板、MAC琼脂平板及SMAC琼脂平板上，于35℃下培养24 h观察结果。

SS琼脂平板：菌落较小、红色、圆形、光滑、凸起、边缘整齐。

MAC琼脂平板：不透明、粉红色或红色菌落，少数呈黏稠状菌落。

SMAC琼脂平板：大肠埃希菌O157：H7菌落呈圆形、无色、中等大小、光滑凸起。

2.涂片、革兰染色、镜检　大肠埃希菌为革兰阴性短杆状、两端钝圆的杆菌，多呈单个分散存在。

3.生化反应

（1）原理及方法见前面的实验。

（2）其他生化反应：将大肠埃希菌分别接种在KIA培养基、MIU培养基、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐琼脂斜面、硝酸盐培养基管中，35℃培养18～24 h后观察结果，并进一步做触酶实验（表6-1）。

表6-1　大肠埃希菌的初步鉴定

续表

注：A表示酸；K表示碱；C表示枸橼酸盐利用实验。

4.血清学鉴定

（1）EPEC的鉴定：凡生化反应符合大肠埃希菌特征，怀疑为EPEC感染者，取KIA培养基上的培养物分别与EPEC OK多价Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组诊断血清做玻片凝集实验。如与其中某一组多价血清凝集则继续与该组单价分型血清做玻片凝集实验，若发生凝集，表示细菌具有某型EPEC的K抗原，需进一步鉴定其O抗原型别。先将菌液加热100℃、1 h，再与该分型血清进行玻片凝集实验，以确定O抗原型别。根据O、K抗原鉴定结果可判断EPEC的血清型。

（2）EIEC的鉴定：血清学鉴定方法与EPEC相同，血清学分型为O152和O124。因与志贺菌的抗血清有交叉反应，且生化反应与临床表现相似，需注意鉴别，主要鉴别实验：醋酸盐、葡萄糖铵利用实验，黏质酸盐产酸实验，EIEC均为（+），志贺菌为（-）。

（3）EHEC（O157：H7）鉴定：挑选MAC琼脂平板上的无色、中等大小菌落，且生化反应符合标准大肠埃希菌生化反应，用O157抗血清做胶乳凝集实验，检测其O157抗原。

（4）ETEC的鉴定：通过分离培养、生化反应、血清学分型和肠毒素测定等做出鉴定。

（5）EAEC：采用液体培养凝集实验，通过检测细菌对HEP-2细胞或Hela细胞的黏附性进行鉴定。

（六）注意事项

（1）氧化酶实验遇铁时易出现假阳性，所以，应避免接触含铁物质。氧化酶试剂（盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺）在空气中易被氧化，应经常更换新鲜配制的试剂，或配制时试剂内加入0.1%维生素C以减少自身氧化。另外，实验观察时间过长也会导致假阳性。

不宜采用含葡萄糖培养基上的菌落，因葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性，影响实验结果的准确性。

由于SS琼脂中化学成分和生化反应复杂，故对肠道杆菌进行触酶和氧化酶实验时，应从营养琼脂平板上取菌进行实验，方能正确反映实验结果。

（2）大肠埃希菌各血清型间的抗原关系十分密切，特别是O抗原。玻片凝集实验仅用于阴性标本筛选，确定实验须做定量凝集实验。

（七）思考题

（1）卫生细菌学检验有哪些指标？各有何意义？

（2）肠杆菌科细菌的共同生物学特性及检验要点有哪些？