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链球菌属细菌种类多，分布广，有的作为正常菌群寄居于人体的上呼吸道、消化道、泌尿生殖道，有的是皮肤上的过路菌，还有某些菌种为毒力强的致病菌。引起人类致病的主要是A群链球菌，可引起急性咽炎、呼吸道感染、丹毒、脓疱病、软组织感染、心内膜炎和脑膜炎等，还可引起猩红热以及感染后的变态反应性疾病如急性肾小球肾炎、风湿热等。无乳链球菌是新生儿菌血症和脑膜炎的常见菌，该菌还可引起孕妇胎膜早破，对成人主要引起肾盂肾炎、子宫内膜炎等；C、G群β溶血性链球菌主要通过手术和创伤引起感染；肺炎链球菌主要引起支气管炎、大叶性肺炎、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎和菌血症，是社区获得性肺炎的主要病原菌之一，临床较为常见；草绿色链球菌可引起心脏瓣膜异常患者亚急性细菌性心内膜炎，血液链球菌、温和链球菌、口腔链球菌、中间型链球菌等常分离自深部脓肿，特别是肝和脑的脓肿。

（二）链球菌属的检验程序

链球菌属检验程序见图5-3。不同的临床样本，分别采取相应的处理方式。

（三）目的要求

1.掌握　链球菌属的形态及培养特性，A、B群链球菌和肺炎链球菌的鉴定方法。

2.熟悉　链球菌属的鉴定依据。

（四）器材与试剂

1.菌种　A群链球菌、B群链球菌、D群链球菌、肺炎链球菌与甲型链球菌等。

2.培养基　血琼脂平板，血清肉汤、胆汁七叶苷、6.5%氯化钠肉汤、M-H血琼脂平板等。

3.试剂　新鲜血浆、3%过氧化氢溶液、10%去氧胆酸钠溶液、革兰染色试剂、链球菌胶乳凝集实验试剂（A，B，C，D，…，G群），杆菌肽药敏纸片、Optochin药敏纸片等。

4.其他　接种环、载玻片、黑色玻璃板、加样枪、无菌枪头、游标卡尺、酒精灯、光学显微镜、生物安全柜、培养箱等。

（五）步骤与方法

（1）平板分离培养：分别将A、B、D群链球菌，肺炎链球菌，草绿色链球菌分区划线接种于血琼脂平板，置于5%～10%CO2环境，35℃培养箱中孵育18～24 h。注意链球菌的营养要求高，须在培养基中加入血液、血清才能生长，肺炎链球菌和草绿色链球菌某些种的培养需要CO2。链球菌在血琼脂平板上形成灰白色小菌落，不同菌种的菌落可形成α、β、γ三种特征性溶血现象，A、B群链球菌为灰白色、圆形、凸起、直径约1 mm、呈β溶血的菌落。肺炎链球菌为微绿色、扁平、光滑的呈α溶血的菌落，中心可有下陷感，培养48 h后呈“脐窝状”菌落，见图5-4及文后彩图。D群链球菌、草绿色链球菌菌落稍小，呈α溶血。

（2）血清肉汤培养：分别将A、B、D群链球菌，肺炎链球菌，草绿色链球菌接种于血清肉汤中，置于5%～10%CO2环境，35℃培养箱中孵育18～24 h。链球菌在液体培养基中表现为絮状和颗粒沉淀。

2.涂片染色镜检　分别取A、B、D群链球菌，草绿色链球菌培养物进行涂片、染色、镜检。链球菌镜下呈单个、成双、成链状或短链状排列的圆形、革兰阳性球菌。在尿液、脓液、胸腔积液、腹腔积液、血液标本及肉汤中直接涂片，革兰染色镜检中链球菌排列可呈长链状。肺炎链球菌多呈矛头状、宽端相对尖端向外、成双排列的革兰阳性球菌，在液体标本涂片染色中菌体周围可见荚膜。

1）触酶实验　挑取链球菌的培养物进行触酶实验，具体操作及结果判断见上一节葡萄球菌属中相关内容。链球菌属触酶实验阴性。

2）杆菌肽敏感实验

（1）原理：A群链球菌对杆菌肽几乎100%敏感，而其他群链球菌对杆菌肽通常耐药。

（2）方法：将待检链球菌分别密集划线于MH血琼脂平板上，粘贴0.04 U杆菌肽药敏纸片，35℃培养箱中孵育18～24 h后观察。

（3）结果判断：杆菌肽周围出现抑菌圈为敏感，则推断被检菌为A群链球菌。无抑菌圈者为阴性。

（1）原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进金黄色葡萄球菌β溶血素活性。在血琼脂平板上2种细菌交界处溶血能力增强，形成箭头状的透明溶血区。

（2）方法：在血琼脂平板上，用金黄色葡萄球菌ATCC25923划线接种一条直线，再分别将待检链球菌在距金黄色葡萄球菌接种线3～10 mm处呈垂直直线方式接种一条短直线，用同样的方法接种阴性、阳性对照菌，35℃、5%～10%二氧化碳培养箱中孵育18～24 h后观察。

（3）结果判断：2接种线之间出现箭头状的扩大透明溶血区者为阳性。未出现扩大溶血区者为阴性，B群链球菌CAMP实验阳性，见图5-5。

4）Optochin敏感实验

（1）原理：Optochin（即乙基氢化去甲奎宁）对肺炎链球菌有特异抑制作用，可干扰肺炎链球菌叶酸的生物合成，抑制该菌生长，而使肺炎链球菌对其敏感；Optochin对其他链球菌无抑制作用，故其他链球菌表现为耐药。

（2）方法：将肺炎链球菌、草绿色链球菌分别密集划线于血琼脂平板上，粘贴5 μg Optochin药敏纸片，35℃、5%～10%二氧化碳培养箱中孵育18～24 h后观察结果。

（3）结果判断：Optochin抑菌圈直径≥14 mm为敏感，＜14 mm为阴性。

5）胆汁溶菌实验

（1）原理：肺炎链球菌能产生自溶酶，胆汁或胆盐可加速肺炎链球菌本身自溶过程，促使菌体发生自溶，溶解肺炎链球菌而使菌落消失。

（2）方法：①平板法：直接将10%去氧胆酸钠溶液滴在菌落上，置于35℃孵育30 min后观察结果。②试管法：直接将20%去氧胆酸钠溶液0.1 mL滴入1 mL血清肉汤培养物中，摇匀后置于35℃培养箱中孵育，30～60 min后观察。

（3）结果判断：平板法以菌落消失为阳性；试管法以加胆盐的培养物变澄清、透明者为阳性，而对照管仍混浊为阴性。

6）七叶苷分解实验

（1）原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。

（2）方法：将待检链球菌接种于七叶苷生化微管培养基中，35℃培养箱中孵育18～24 h后观察。

（3）结果判断：生化微管中培养基变为黑色或棕褐色者为阳性，不变色者为阴性。D群链球菌和肠球菌属七叶苷分解实验阳性。

7）吡咯烷酮芳基酰胺酶（PYR）实验

（1）原理：有些细菌能产生吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮β-萘酚酰胺（PYR）基质，释放出β-萘酚酰胺，后者与N，N-二甲氨基肉桂醛反应，产生桃红色者为阳性。

（2）方法：直接取新鲜培养的菌落，涂布于含有PYR的试纸上，置于35℃培养箱中孵育5 min，滴加显色剂后观察结果。

（3）结果判断：滴加显色剂1 min后若阳性则显红色，无颜色变化者为阴性。A群链球菌和肠球菌PYR实验阳性。

8）链球菌快速胶乳凝集实验

（1）原理：用已知的A、B等各群抗原的免疫血清分别致敏的胶乳颗粒，与待检链球菌进行间接胶乳凝集反应，该菌与相对应的群的胶乳颗粒能产生肉眼可见的凝集现象。

（2）方法：挑取2～3个待检菌落混悬于已加入0.4 mL提取酶的试管中，并使其乳化均匀，置于35℃水浴10～15 min。在水浴的同时在卡片的相应区域各加1滴A，B，C，…，G群抗体致敏胶乳液，然后分别加入提取酶已处理完成的菌悬液各1滴，混匀，轻轻摇动卡片，观察结果。

（3）结果判断：在2～10 min内发生胶乳凝集者为阳性。待检菌与哪群抗体致敏的胶乳颗粒凝集，就表明该菌为相应血清群的链球菌。

9）肺炎链球菌胶乳凝集实验

（1）原理：肺炎链球菌与肺炎链球菌胶乳混合能产生特异性的抗原抗体反应，产生肉眼可见的凝集现象。

（2）方法：在两片干燥、洁净的载玻片上各加1滴生理盐水并加入待检菌，研磨均匀制得菌悬液；在一片载玻片上加1滴抗肺炎链球菌胶乳，在另一载玻片上加1滴质控胶乳，分别搅拌混匀后轻轻摇动载玻片，于2 min内读取结果。

（3）结果判断：2 min内待检菌与抗肺炎链球菌胶乳出现反应，产生清晰可见的凝集，而不与质控胶乳发生凝集者为阳性，与两个试剂均不产生凝集者为阴性。

10）荚膜肿胀实验

（1）原理：特异抗血清和相应荚膜细菌相互作用，使细菌的荚膜明显增大，细菌的周围有较宽的环状带。

（2）方法：取洁净载玻片两侧各加待检菌1～2接种环，一侧加抗细菌荚膜血清，另一侧加正常血清各1～2接种环，混匀；两侧各加1%美蓝溶液1接种环，混匀，分别加盖玻片，放置于湿盒中5～10 min，镜检。

结果判断：阳性：镜下观察在蓝色细菌周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物，而在对照侧则无此现象。阴性：实验和对照物侧均不产生无色环状物。肺炎链球菌荚膜肿胀实验阳性。

11）其他　有条件的实验室可进行质谱分析或测序技术进行菌种鉴定。

链球菌属内的鉴定实验见表5-3。

（六）注意事项与小结

（1）杆菌肽敏感实验时，已接种待检菌并粘贴了杆菌肽药敏纸片的M-H血琼脂平板，应置于35℃普通培养箱中孵育，而不能放入5%～10%二氧化碳培养箱中，否则影响结果判读。

（2）进行胆盐溶菌实验时，应仔细观察消失的菌落是溶菌还是被试剂冲走移位。

（3）链球菌快速胶乳凝集实验时，待检菌必须为纯培养物，且实验的菌量需足够，如果待检菌的菌量不够，可能出现假阴性结果。

（4）自凝菌株不能用链球菌快速胶乳凝集实验分群；若所有的胶乳试剂都出现凝集，必须重做实验。

（5）非溶血菌株可以与A、B、C、F或G群胶乳悬液反应，需用生化方法进行鉴定；α溶血或非溶血性菌株的血清学实验不明显，也需要进行生化实验以鉴定分离株。

（6）链球菌快速胶乳凝集实验时，一些D群链球菌也可以和G群发生凝集反应，因此应以生化反应为金标准。

（7）肺炎链球菌胶乳试剂在使用前应将试剂盒置于室温（18～25℃）中平衡20 min，使用时混匀胶乳试剂，并防止滴瓶中泡沫滴至实验玻片上。