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葡萄球菌属在自然界广泛分布，也可存在于人和动物的皮肤黏膜表面而成为正常菌群中的成员。目前临床上根据凝固酶不同分为凝固酶阳性葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌，其中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌是人类重要的致病菌，临床常见的感染有疖、痈、创伤、手术切口等局部化脓性感染和骨髓炎、化脓性关节炎、心内膜炎、肺炎、菌血症等全身性感染，尤其是金黄色葡萄球菌所致的坏死性肺炎、脓毒血症或葡萄球菌烫伤样皮肤综合征（SSSS综合征），病死率较高。此外，金黄色葡萄球菌还可引起食物中毒等其他疾病。目前金黄色葡萄球菌已成为致病性最强、临床检出率最高的革兰阳性球菌。

（二）金黄色葡萄球菌的检验程序

金黄色葡萄球菌的感染常以急性、化脓性为特征，如果未得到有效治疗，感染可扩散至周围组织或经菌血症转移至其他器官而引起重度感染，如坏死性肺炎等病情进展迅速，病症凶险，因此如何快速检验、报告、尽早评估、及时有效地抗感染治疗，是治疗成功的关键。金黄色葡萄球菌的检验程序见图5-1。不同的临床样本，分别采取相应的处理方式。

（三）目的要求

1.掌握　金黄色葡萄球菌的检验程序，检验方法。

2.熟悉　葡萄球菌属的鉴定与鉴别要点。

3.应用　临床标本中金黄色葡萄球菌的鉴定，培养学生实际检验能力。

（四）器材与试剂

1.菌种　金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌等。

2.培养基　普通琼脂平板、血琼脂平板、高盐甘露醇平板、M-H琼脂平板、DNA酶平板、O/F培养基、甘露醇发酵管等生化微量管。

3.试剂　3%过氧化氢溶液、革兰染液、EDTA-K2抗凝新鲜血浆、1 mol/L盐酸、生理盐水、无菌液体石蜡、新生霉素药敏纸片等。

4.其他　比浊仪和0.5麦氏标准比浊管、培养箱、光学显微镜和油镜、载玻片、毫米尺或游标卡尺、小镊子、接种环、接种针、酒精灯、无菌棉拭子、小试管、无菌吸管、记号笔等。

（五）步骤与方法

1.分离培养　将上述样本以分区划线方式分别接种于血琼脂平板、高盐甘露醇平板、普通琼脂平板，置于35℃培养箱中孵育18～24 h后观察细菌菌落特征。表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌在普通培养基上形成直径为2～3 mm不透明的圆形、凸起、光滑菌落，表皮葡萄球菌呈灰白色菌落，腐生葡萄球菌呈微黄色不溶血菌落。金黄色葡萄球菌为直径2～3 mm的圆形、凸起、边缘光滑菌落，并产生金黄色非水溶性色素，典型菌落在血琼脂平板上能产生β溶血环，在高盐甘露醇平板上为黄色菌落。

2.涂片染色镜检　菌落经涂片、固定、革兰染色，镜下呈单个、成双、短链或葡萄状排列，关键是呈葡萄串状的排列方式，是葡萄球属的镜下特点，尤其是金黄色葡萄球菌，其菌体镜下较小，大小较均匀一致，且排列多呈葡萄串状而显得较为“秀气”。

（1）原理：具有触酶的细菌能催化过氧化氢释放出初生态氧，继而形成氧分子而产生气泡。

（2）方法：挑取平板上的菌落，置于洁净的玻片上，滴加新鲜配制的3%过氧化氢溶液1～2滴，静置，在1 min内观察结果。

（3）结果判断：1 min内出现明显气泡者为阳性，无气泡产生者为阴性，葡萄球菌属触酶实验阳性。

（1）原理：又称氧化/发酵实验，观察细菌分解葡萄糖过程中是利用分子氧（氧化型）还是无氧酵解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱型）。

（2）方法：分别将金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、虅黄微球菌各接种两支O/F培养基生化管，其中一支加入无菌液体石蜡，加至培养基液面0.3～0.5 cm高度。置于35℃培养箱中孵育18～24 h后观察结果。

（3）结果判断：仅开放管产酸为氧化型，两管都产酸为发酵型，两管均不变为产碱型。葡萄球菌属为发酵型，以此与微球菌属相鉴别。

3）血浆凝固酶实验

（1）原理：金黄色葡萄球菌能产生两种凝固酶，一种是结合凝固酶或凝集因子，是结合在菌体细胞壁上的凝固酶，能与血浆中的纤维蛋白原交联而使菌体快速凝集，可用玻片法测出；另一种是游离凝固酶，是菌体生成后分泌至菌体外的凝固酶，能使凝血酶原变成凝血酶类物质，使纤维蛋白原转变成纤维蛋白，而使血浆凝固，可用试管法测出。

（2）方法：分为玻片法和试管法。

①玻片法：取一滴生理盐水于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌2～3个涂于生理盐水中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。然后加一环EDTA抗凝兔血浆混合，10 s内观察结果。实验同时应做阳性、阴性对照。

②试管法：准备EDTA抗凝兔血浆，取0.5 mL于无菌小试管内，然后挑取3～5个待检菌的菌落于稀释的血浆中混匀，置于35℃培养箱中孵育3～4 h后读取结果（若结果不明显可继续观察至24 h）。实验同时应做阳性、阴性对照。

（3）结果判断：玻片法测定结合凝固酶，试管法测定游离凝固酶。玻片法在10 s内能看到玻片上菌悬液内有明显凝集现象为阳性，无凝集现象者为阴性；试管法凝固酶阳性时能看到试管内产生淡黄色胶胨状物质，无胶胨状物质形成者为阴性。金黄色葡萄球菌玻片法、试管法凝固酶均呈阳性反应。表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌等玻片法、试管法凝固酶均呈阴性反应。

（1）原理：金黄色葡萄球菌能产生细胞外DNA酶，DNA酶可水解DNA长链而形成寡核苷酸链。DNA长链可被酸沉淀，而水解后形成的寡核苷酸链可溶于酸，当培养后的菌落平板上加入酸后，若菌落周围出现透明环，表明有寡核苷酸链形成，从而反推出该菌能产生DNA酶。

（2）方法：用接种针挑取待检菌点种在DNA酶琼脂平板上，并在平板上分别点种DNA酶阳性菌株（如沙雷菌或变形杆菌或卡他布兰汉菌）和阴性菌株做对照，将DNA酶琼脂平板置于35℃培养箱中孵育18～24 h后，快速将1 mol/L盐酸8～10滴滴在DNA酶琼脂平板上，覆盖待检菌和阴、阳性对照菌（使菌落浸没），1～2 min后观察结果，并应于10 min内观察完毕。

（3）结果判断：待检菌菌落周围出现透明圈者为阳性，未出现透明圈者为阴性（图5-2）。金黄色葡萄球菌DNA酶阳性，其他葡萄球菌DNA酶阴性或微弱阳性。

注：a表示待检菌DNA酶阳性；b表示DNA酶阳性对照；c表示DNA酶阴性对照。

5）甘露醇发酵实验

（1）原理：有些细菌能发酵分解甘露醇，产酸，使培养基变为黄色。

（2）方法：分别将金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌接种于甘露醇微量发酵管，置于35℃培养箱中孵育18～24 h后观察结果。

（3）结果判断：培养基变为黄色为阳性，不变色为阴性。金黄色葡萄球菌甘露醇发酵实验阳性；表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌甘露醇发酵实验阴性。

6）新生霉素药敏实验

（1）原理：利用某些葡萄球菌对新生霉素的敏感度不同进行实验。

（2）方法：分别制备0.5麦氏浊度的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌菌悬液，将菌悬液均匀涂于M-H琼脂平板，贴上每片含5 μg的新生霉素纸片，35℃孵育16～20 h后观察结果。

（3）结果判断：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌对新生霉素敏感（抑菌圈直径＞12 mm），腐生葡萄球菌对新生霉素耐药。

7）诊断血清凝集实验

（1）原理：用金黄色葡萄球菌的诊断血清与待检菌及生理盐水在载玻片上混合，若出现肉眼可见的特异性凝集块，表示该菌即为金黄色葡萄球菌。

（2）方法：取一洁净载玻片，用接种环挑取待检菌分别与诊断血清及生理盐水混匀，摇动玻片约10 s，1～3 min后观察结果。

（3）结果判断：待检菌与诊断血清混合后明显凝集，而与生理盐水混合后呈均匀混浊者为阳性，可鉴定为金黄色葡萄球菌。待检菌与诊断血清、生理盐水混合后都呈均匀混浊者为阴性。待检菌与诊断血清、生理盐水混合后均凝集者为自凝现象。

葡萄球菌属内各常见菌种鉴定方法如表5-1所示。

注：“±”表示迟缓弱阳性；“d”表示21%～79%阳性；“（d）”表示不确定阳性；“（+）”表示有时阳性不明显。

（六）注意事项

（1）触酶实验不宜用金属环挑菌后直接在过氧化氢溶液中涂抹，也不宜直接在血琼脂平板上进行触酶实验，以免出现假阳性；因红细胞内含有触酶，故不宜挑取血琼脂平板上菌落底层的细菌做触酶实验。细菌要求新鲜，所用的过氧化氢溶液应新鲜配制或密封保存；每次实验时，应用阳性和阴性菌株做对照。

（2）若有少量气泡生成使触酶实验结果不确定时，可采用替代方式：先在玻片上滴1滴3%过氧化氢溶液，用无菌滤纸挑取非血琼脂平板上菌落，点在过氧化氢溶液中，有气泡者为触酶阳性，无气泡者为触酶阴性。

（3）玻片法凝固酶实验不可用高盐培养基上的菌落，否则可能出现细菌自凝现象，造成假阳性。玻片法凝固酶实验的菌悬液浓度宜大，结果应在10 s内观察。

（4）观察试管法凝固酶实验结果时，应轻轻倾斜试管，不要用力振摇试管，以防凝块迅速收缩或被破坏。

（5）某些菌株产生的葡激酶在延长孵育时间后可使胶胨状物质溶解使之产生假阴性，因此做试管法凝固酶实验时，试管置于37℃孵育4 h必须观察1次结果，阴性者应继续孵育至24 h，因有些金黄色葡萄球菌产生的凝固酶量少，需培养24 h后才能观察到凝固酶活性。培养24 h仍未见胶胨状物质者，才能判断为试管法凝固酶实验阴性。

（6）玻片法可作为快速筛选实验，而试管法为凝固酶实验的金标准，但耗时稍长，所以玻片法阴性或不确定时需用试管法证实。另外，少数金黄色葡萄球菌玻片法阴性，试管法阳性，因该金黄色葡萄球菌无结合凝固酶，有游离凝固酶，应引起注意。

（7）有条件的实验室可通过质谱分析或测序技术进行菌种鉴定。

（8）所有操作应在超净工作台或生物安全柜中进行。

（1）试述金黄色葡萄球菌的菌落、镜下特点和主要的生化反应结果。

（2）填写下表，试述三种葡萄球菌的主要生化反应鉴别要点（表5-2）。