二、稀释法

稀释法药敏实验可用于定量测定抗菌药物对细菌的体外抑菌活性，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。肉汤稀释法根据肉汤使用量分为宏量肉汤稀释法和微量肉汤稀释法，前者肉汤量每管≥1.0 mL（通常2 mL），后者肉汤量每孔0.1 mL，商品化的微量稀释板上含有多种经对倍稀释的冻干抗菌药物，操作方便，广泛应用于临床。

稀释法多用于抗菌药物抗菌效力的测定和新药研发。目前临床的自动化或半自动化的药敏实验多采用与此类似的微量稀释法。

（一）目的要求

（1）掌握微量肉汤稀释法的原理、操作方法与结果判定。

（2）熟悉稀释法药敏实验的质控。

（二）器材与试剂

1.菌株　非苛养型细菌临床分离株和相应的质控标准菌株。

2.培养基与试剂　离子校正的水解酪蛋白（M-H）肉汤、M-H琼脂、无菌生理盐水、蒸馏水、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 6.0）、药敏纸片等。

3.器材　超净工作台、恒温培养箱、0.5麦氏标准比浊管、微量加样枪、无菌96孔聚苯乙烯培养板、多头接种器、无菌枪头、湿盒、接种环等。

（三）原理

1.肉汤稀释法原理　以M-H肉汤将抗菌药物进行不同浓度的稀释，再接种待检细菌。定量测定抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。

2.琼脂稀释法原理　将不同剂量的抗菌药物加入溶化并冷却到50℃左右的定量M-H琼脂中，制成含药物浓度递减的平板。接种待检细菌，35℃培养16～24 h，无细菌生长的最低药物浓度为待检菌的MIC。

（四）步骤与方法

1.培养基　使用M-H肉汤或M-H琼脂培养基，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在M-H肉汤中加入补充成分可促进流感嗜血杆菌、链球菌生长。M-H肉汤或M-H琼脂培养基制备完毕后应校正pH为7.2～7.4（25℃）。离子校正的M-H肉汤（cation-adjusted Mueller-Hinton broth，CAMHB）为目前推荐的药敏实验培养液。

2.抗菌药物原液制备　抗菌药物应使用标准品，直接购自厂商或相关机构，所需的溶液量或粉剂量可根据以下公式进行计算：

药物称量（mg）=溶剂量（mL）×原液浓度（μg/mL）/药物效价（μg/mg）

加入溶剂量（mL）实称药物量（mg）×药物效价（μg/mg）/原液浓度（μg/mL）

一般原液浓度为测定最高浓度的10倍，肉汤稀释法常用的原液浓度为1280 μg/mL，琼脂稀释法常用的原液浓度为5120 μg/mL。配制各种抗菌药物的溶剂根据药物性能选择蒸馏水，pH 6.0、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液等。配制好的药物原液应储存于-60℃以下环境，保存时间不超过6个月。

3.抗菌药物稀释　微量肉汤稀释法可将抗菌药物原液稀释至2倍终末所需各浓度梯度，备用；琼脂稀释法可将原液稀释至10倍终末所需各浓度梯度，备用。

4.菌液制备　挑取培养18～24 h细菌纯培养物于M-H肉汤增菌4～6 h，制成0.5麦氏标准的菌悬液，再以M-H肉汤稀释，使含菌量至107CFU/mL。

5.接种

1）微量稀释法　在聚苯乙烯微孔板一排各孔中加入某种递减浓度的抗菌药物，每排一种抗菌药物或一个浓度的抗菌药物，每孔100 μL，随后等量加入100 μL 107CFU/mL菌悬液。

为防止蒸发，接种好的微孔板要盖好盖子，置于35℃培养箱中，大气环境培养16～20 h，对可能的耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）、耐万古霉素的肠球菌（VRE）培养时间应满24 h。

2）琼脂稀释法

（1）含抗菌药物琼脂制备：将已稀释的抗菌药物按1∶9（抗菌药物2 mL∶溶化琼脂18 mL）加入在45～50℃水浴中平衡溶化的M-H琼脂中，充分混合后倾入平皿，边加边轻轻摇晃平板，使抗菌药物与培养基充分混合。室温凝固后的含药平板装入密闭塑料袋中，置于2～8℃保存，储存5天。对易降解药物如头孢克洛，在使用前48 h内制备平板，临用前应在室温中平衡，放于35℃培养箱中30 min使琼脂表面干燥。

（2）接种培养：以多头接种器吸取备好的菌悬液（1～2 μL），接种于琼脂表面，稀释菌悬液应于15 min内接种完毕，接种后置于35℃培养16～20 h，MRS、VRE孵育时间需满24 h。奈瑟菌属、链球菌属细菌置于5%CO2中培养，幽门螺杆菌需置于微需氧环境中培养。多头接种器一次可接种36～52个菌株，接种量为1～2 μL。

6.结果判断与报告

1）微量稀释法　以抑制待检菌肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对检验菌的MIC。在读取和报告所测菌株的MIC前，应先检查生长质控管或孔（不含抗菌药物）的细菌生长情况，同时还应检查接种物的传代培养情况，以确定其是否被污染及接种量是否合适，质控菌株的MIC值应处于合适的质控范围。

2）琼脂稀释法　平皿置于暗色、无反光物体表面判定实验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。接种处出现单个菌落或模糊薄雾状可忽略不计。在含甲氧苄啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为MIC。MIC单位为μg/mL，根据CLSI标准报告相应的敏感、中介或耐药。

7.质控　对于常见需氧菌和兼性厌氧菌，M-H琼脂、孵育时间、环境、质控菌株同纸片扩散法。每次实验应选用金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下做平行实验。如果标准菌株的实验结果超过或低于预期值一个稀释度以上，不应发出临床报告，而应找出差错的原因。

（五）注意事项

（1）培养基、接种菌量、蛋白质结合率、抗菌药物的配制、结果观察的时间等因素均能影响本实验的结果。此外，液体稀释法不适用于做磺胺药物等抑菌剂的药敏实验，可用琼脂稀释法进行实验。

（2）抗菌药物的质量须保证，应为直接购自厂商或相关机构的原料药或标准品。实际浓度需根据原料说明书的纯度进行换算。

（3）肉汤稀释法如果出现单一的跳孔或跳管现象，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度；若出现多处跳孔或跳管，或琼脂稀释法出现低浓度药物琼脂平板不生长而高浓度生长现象，应检查培养物纯度或重复实验。

（4）为减少抗菌药物的蒸发和变质，试管应盖紧并于4～8℃保存，稀释好的抗菌药物溶液应在5天内使用。含药的微量稀释盘应用塑料袋密封包装并立即置于不高于-20℃（最好不高于-60℃）保存至需要时，在-20℃大多数抗菌药物原液可保存三个月，而在4℃下只能保存一周，但某些不稳定的抗菌药物除外，如亚胺培南、头孢克洛、克拉维酸等。解冻的抗菌药物溶液不能重新冷冻，因反复冻融会加速某些抗菌药物，特别是β-内酰胺类药物的降解。

（六）思考题

（1）请分析稀释法设立质控的意义。

（2）比较稀释法和纸片扩散法的区别。