一、纸片扩散法

纸片扩散法又称Kirby-Bauer（K-B）法，通过测量药敏纸片的抑菌环直径的大小区分敏感度，由于纸片扩散法在抗菌药物的选择上具有灵活性，且花费低廉，被WHO推荐为定性药敏实验的基本方法而广泛应用。

（一）目的要求

（1）掌握纸片扩散法（K-B法）药敏实验原理、方法和结果判定。

（2）熟悉纸片扩散法药敏实验的质量控制（简称质控）。

（二）器材与试剂

1.菌株　非苛养型细菌临床分离株和相应的质控标准菌株。

2.培养基与试剂　水解酪蛋白（M-H）琼脂平板、无菌生理盐水、药敏纸片等。

3.器材　超净工作台、恒温培养箱、0.5麦氏标准比浊管、游标卡尺或带刻度直尺、无菌棉拭子、无菌小镊子、接种环、酒精灯等。

（三）原理

将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明圈即为抑菌环。抑菌环直径的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌环直径越大，MIC越小。

（四）步骤与方法

1.培养基制备　水解酪蛋白（M-H）培养基是CLSI推荐采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏实验标准培养基，pH为7.2～7.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂平板厚度为4 mm，配制灭菌后的M-H琼脂平板当天使用或置于塑料密封袋中4℃保存，使用前应将平板置于35℃温箱孵育15 min，使其表面干燥。

2.抗菌药物纸片制备　选择直径为6.35 mm，吸水量为20 μL的专用药敏纸片，用逐片加样或浸泡方法使每片含药量达规定所示。药敏纸片密封储存于2～8℃或-20℃冰箱，β-内酞胺类药敏纸片应于-20℃冷冻储存，使用前将药敏纸片储存瓶移至室温平衡1～2 h，避免开启储存瓶时产生冷凝水。

3.菌悬液制备　挑取培养16～24 h的细菌纯培养物（实验菌株或质控标准菌株）置于无菌生理盐水管中，充分研磨并混匀后校正浓度至0.5麦氏标准（含菌量约为1.5×108 CFU/mL）。

4.接种与培养　用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁将多余菌液旋转除去后，在M-H琼脂平板（测试链球菌时需应用加脱纤维血的M-H琼脂平板）表面均匀涂抹接种3次。每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹1周，确保涂布均匀。平板置室温下干燥3～5 min，参照CLSI标准选择已平衡至室温并在保质有效期内的药敏纸片，用无菌镊子将其紧贴于琼脂表面，镊尖轻压一下纸片，使其贴平。各纸片中心距离应大于24 mm，纸片的中心距平板内缘大于15 mm，直径90 mm的平板最多贴7张药敏纸片（见图3-1），纸片贴上后不可再移动，因为抗菌药物会自动扩散到培养基内。将贴好药敏纸片的平板倒置于35℃恒温培养箱18～24 h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素敏感实验应孵育24 h以上。

图3-1　药敏实验（纸片扩散法）

5.结果判断和报告　用游标卡尺或带刻度直尺量取抑菌环直径（抑菌环的边缘应是无明显细菌生长的区域），先量取质控标准菌株的抑菌环直径，以判断质控是否合格。然后量取实验菌株的抑菌环直径。根据CLSI标准，对照细菌对抗生素敏感度判断表（表3-1）做出“敏感”“耐药”和“中介”的判断。敏感（susceptible，S）是指所分离菌株能被测试药物使用推荐剂量在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制；耐药（resistant，R）是指所分离菌株不被测试药物常规剂量可达到的药物浓度所抑制，提示分离菌株可能存在某些特定的耐药机制，或药物对分离菌株的临床疗效不可靠；中介（intermediate，Ⅰ）是指抗菌药物在生理浓集的部位具有临床效果，还代表敏感与耐药之间的缓冲区，以避免微小的、不能控制的技术因素造成重大结果解释失误。

表3-1　常用药敏实验药敏纸片判断标准与其相应的MIC近似值

注：MIC表示最低抑菌浓度。

6.质控

1）质控意义　质控标准菌株随标本一起进行药敏实验，测定质控标准菌株的抑菌环。只有质控菌株的抑菌环在CLSI规定的标准菌株药敏实验判断折点允许范围内，才说明药敏实验质控合格。

2）质控频率　连续30天质控合格，每周可做1～2次，若发现有失控的情况，就必须每日做1次，寻找失控的原因并予以纠正。若连续30天失控少于3次，则可以恢复每周1次。

3）质控菌株和培养条件

（1）对于肠杆菌科细菌，质控标准菌株推荐为大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺酶抑制剂纸片用），培养16～18 h，观察结果。

（2）对于铜绿假单胞菌，质控标准菌株推荐为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺酶抑制剂纸片用），培养16～18 h，观察结果。

（3）对于不动杆菌属细菌、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌，质控标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺酶抑制剂纸片用），培养20～24 h，观察结果。

（4）对于葡萄球菌属细菌，16～18 h观察结果，测对苯唑西林、甲氧西林、奈夫西林和万古霉素需24 h，实验温度超过35℃不能检测耐甲氧西林葡萄球菌，推荐质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺酶抑制剂纸片用）。

（5）对于肠球菌属细菌，培养16～18 h，观察结果，测万古霉素需24 h。推荐质控标准菌株为粪肠球菌ATCC29212。

（6）对于流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌，推荐质控菌株为流感嗜血杆菌ATCC49247、流感嗜血杆菌ATCC49766、大肠埃希菌ATCC35218（测阿莫西林/克拉维酸时），5%CO2培养16～18 h，观察结果。

（7）对于淋病奈瑟菌，培养基为GC琼脂+1%特定的生长补充品，36±1℃，不超过37℃，5%CO2培养20～24 h，观察结果，推荐质控标准菌株为淋病奈瑟菌ATCC49226。

（8）对于肺炎链球菌和肺炎链球菌之外的其他链球菌，培养基为M-H琼脂+5%脱纤维羊血，质控标准菌株为肺炎链球菌ATCC49619，5%CO2培养20～24 h，观察结果。

（五）注意事项

1.培养基成分　培养基的成分对药敏实验结果影响很大，蛋白胨中含有氨基苯甲酸，可中和磺胺类药物的作用。培养基中如含有胸腺嘧啶可使甲氧苄啶失去活性。

2.培养基pH M-H培养基必须符合实验要求，以pH 7.2～7.4适宜。

3.培养基厚度　培养基厚度为4 mm，整体厚薄要均匀一致。

4.培养基中琼脂浓度　标准为17 g/L，琼脂浓度主要影响抗菌药物扩散速率。

5.菌液浓度　标准为1.5×108 CFU/mL，菌液浓度是引起纸片扩散法药敏实验误差的主要因素之一。对0.5麦氏标准比浊管应定期纠正或配制。

6.纸片含药量　纸片含药量也是影响药敏实验结果的重要因素之一。应定期进行质控。

7.接种时间　校正浓度后的菌液应在15 min内接种完毕。

8.平板培养时正确摆放　平板在培养时最好单独摆放，不应数个叠在一起，以免影响温度的均衡而影响结果判断。

9.抑菌圈判定　抑菌圈边缘借助放大镜才能观察到的小菌落生长可忽略不计。变形杆菌由于迁徙生长出现的内圈云雾样生长同样可以忽略。甲氧苄啶和磺胺类药物抑菌圈内会出现微弱生长，应量取抑菌圈外缘。葡萄球菌对苯唑西林的药敏实验或肠球菌对万古霉素的药敏实验，围绕纸片周围只要有极少细菌生长均提示为耐药。清晰的抑菌圈内如有独立的菌落生长，则可能为接种物不纯，或者出现耐药突变株，需要重新进行分离鉴定和药敏实验。

（六）思考题

简单阐述纸片扩散法的注意事项。